La plate-forme a pour vocation le développement de puces à ADN pour l'étude (génomique comparée et analyse du transcriptome) des microorganismes modèles et des maladies infectieuses. Nous disposons de l'équipement nécessaire à la réalisation et l'analyse de macrorrays (dépôts sur membranes Nylon et hybridation avec des sondes radioactives) et de microarrays (dépôts sur lames de verre et hybridation avec des sondes fluorescentes).

La disponibilité des séquences complètes des génomes d'un nombre croissant de microorganismes et les potentialités des nouvelles technologies d'analyse de l'expression des gènes ont incité l'Institut Pasteur à mettre sur pied une plate-forme destinée à la fabrication et à l'analyse des " puces à ADN ". Celle-ci a pour vocation l'étude des microorganismes modèles et des maladies infectieuses. Dans ce dernier cas, nous nous intéressons aussi bien aux agents responsables de ces pathologies (génomique comparée et analyse du transcriptome) qu'à la réponse de l'hôte (analyse du transcriptome). La plate-forme réalise des projets suite à des appels d'offre interne (le premier a eu lieu en Septembre 2000 et le second en Septembre 2001). La plupart des projets retenus ont un cadre national ou européen.

La plate-forme dispose de l'équipement permettant de réaliser les différentes étapes de ces projets :

• Dessin des amorces et amplifications PCR
• Purification, quantification et contrôle qualité des PCR
• Dépôts sur lames de verre et sur membranes Nylon
• Préparation des sondes (fluorescentes et radioactives) et hybridations
• Analyse des signaux d'hybridation et analyse statistique des données

Suite au premier appel d'offre Génopole, 5 projets à grande échelle ont été réalisés et 2 projets sont en cours actuellement :

Pour ces projets qui font appel à la technologie des " macroarrays " (dépôt de fragments PCR sur membranes Nylon et hybridation avec des sondes radioactives) la plate-forme a pris en charge les amplifications PCR (dessin des amorces, réactions d'amplification, contrôle de tous les PCR par électrophorèse en gel d'agarose, contrôle qualité par séquençage de 10 % des produits d'amplification), les dépôts sur membranes et le contrôle qualité des membranes (par hybridation avec un ADN contrôle). Les membranes ainsi réalisées sont en cours d'utilisation par les équipes de l'Institut impliquées dans ces projets.

Parallèlement à la réalisation des projets Macroarrays, un important travail de mise au point de la technologie des microarrays (dépôts sur lames de verre et hybridation avec des sondes fluorescentes) a été réalisé.

• la chimie des lames de verre (trois types de lames sont utilisées : polylysines, amines, aldéhydes)
• le marquage des sondes (marquages direct et indirect d'ARN, marquage d'ADN génomique)
• les procédures de dépôt sur les lames (dépôt de produits PCR et d'oligonucléotides)
• les contrôles de qualité (contrôle des ARN, de l'efficacité des marquages, de la qualité des dépôts)
• la reproductibilité des profils d'expression obtenus

Cette importante étape de mise au point a notamment été réalisée dans le cadre d'un projet d'analyse des programmes d'expression génétique parasitaire chez Plasmodium falciparum (projet réalisé en collaboration avec Peter David, Unité d'Immunologie Moléculaire des Parasites). Dans ce cadre, un jeu de plus de 6000 oligonucléotides (70 mer) couvrant la plupart des gènes de P. falciparum identifiés à ce jour a été déposé sur lames polylysines. Ces lames sont actuellement utilisées pour comparer les profils d'expression de différents stades de développement du parasite.

Maitournam Aboubakar, stagiaire post-doctoral

Sismeiro Odile, Technicienne Supérieure de Laboratoire, osisme@pasteur.fr