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  Pmtg


  Responsable : CLEMENT Jean-Marie (jclement@pasteur.fr)


  resume

 

Notre unité consacre son activité à quatre thèmes. Deux découlent de l'étude d'une région génétique complexe (la région malB) impliquée dans le transport du maltose chez la bactérie modèle Escherichia coli K12 : l'étude de l'organisation du chromosome bactérien (séquences répétées) et l'étude du transporteur du maltose et des systèmes ABC (ATP Binding Cassette). Le troisième thème porte sur les super-intégrons bactériens qui associent des gènes mobiles du chromosome. Le quatrième axe concerne les effets sur les bactéries, et plus récemment sur les souris transgéniques, des agents génotoxiques, capables de créer des dommages dans le matériel génétique.



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Premier thème : BIME, séquences répétées et structure du génome. (Jean-Marie Clément, Sophie Bachellier, Caroline Wilde, Muguette Jehanno, Patricia Lambert).

Un nombre croissant de génomes bactériens entièrement séquencés est accessible dans les banques de données. La génomique fonctionnelle vise à caractériser la fonction des gènes et leur régulation, mais peu de travaux sont consacrés à l'organisation des chromosomes bactériens qui reste encore très mal connue.

Les séquences répétées, habituellement décrites chez les eucaryotes, sont également présentes en abondance chez les procaryotes. Nous avons dévouvert chez E. coli et d'autres entérobactéries voisines les BIME (Bacterial Interspersed Mosaic Elements), une famille de séquences répétées extragéniques. Nous avons entrepris une analyse informatique systématique des génomes complets pour mettre en évidence de nouvelles familles de séquences répétées entre les gènes. Nous y avons consacré une base de données (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/repet/index.html) (S. Bachellier). (Figure1)

L'analyse de régions intergéniques homologues dans des isolats naturels d'E. coli a apporté deux résultats importants :

1) Chaque isolat possède une structure propre quant au type de séquence répétée occupant chaque région. Cette caractéristique a trouvé une application pour le typage des souches, en particulier dans le cas de Bacillus anthracis, l'agent causal de la maladie du charbon.

2) Dans certains isolats, une nouvelle séquence d'insertion (IS1397) est insérée spécifiquement dans les Unités Palindromiques (UP), l'un des motifs de base constitutifs des BIME. Chez K. pneumoniae, nous avons identifié une autre IS (ISKpn1) spécifique des UP. Une telle spécificité de cible est tout à fait originale. Nous avons sélectionné des événements de transposition d'IS1397 chez les entérobactéries (E. coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae et Yersinia pestis). IS1397s'intègre avec une spécificité quasi absolue au niveau des UP de type E. coli tandis qu'ISKpn1semble spécifique des UP de type K. pneumoniae, dont le consensus est différent. Les déterminants responsables de la différence de spécificité entre IS1397 et ISKpn1 sont à l'étude. Une étude menée chez Yersinia pestis, bactérie proche d'E. coli mais dépourvue d'UP, nous a indiqué que des cercles d'ADN composés du module transposable sont probablement des intermédiaires de transposition et que la transposase d'IS1397 reconnait directement sa cible (J-M. Clément, C. Wilde).

La fonction des BIME reste à ce jour hypothétique. Nous avons émis l'idée que certaines d'entre elles permettraient de structurer le chromosome en s'associant à des protéines que nous avons cherché à identifier (technique du simple hybride chez la levure) (S. Bachellier, M. Jehanno).

Deuxième thème : Le transporteur ABC du maltose et analyse phylogénétique des systèmes ABC(Elie Dassa, Philippe Bouige, Dorothée Murat, Olivier Pellegrini, Linda Piloyan)

Les systèmes ABC (ATP-Binding Cassette) constituent la plus grande famille de paralogues. Ils permettent une très grande variété de processus cellulaires, principalement le transport de molécules à travers les membranes, mais aussi la transcription, la traduction, la protection de l'information génétique et leur régulation. Chez l'homme, 15 maladies génétiques graves (dont la mucoviscidose) sont causées par le dysfonctionnement de transporteurs ABC. Le système de transport du maltose et des maltodextrines d'Escherichia coli constitue un paradigme pour les transporteurs ABC, en grande partie grâce à nos travaux. L'étude de son mécanisme d'action est fondamentale pour la compréhension des systèmes humains impliqués dans des pathologies.

Nous poursuivons trois objectifs :

1) Interactions entre les composants du système de transport du maltose chez E. coli

La combinaison de méthodes génétiques (mutagenèse dirigée) et biochimiques (pontages à l'aide de réactifs homo-bifonctionnels) nous a permis de définir les résidus impliqués dans les interactions entre un domaine particulier (hélical) de MalK, l'ATPase qui fournit l'energie, et un domaine restreint (motif EAA) de MalF ou de MalG (protéines membranaires). D'importants changements de conformation se produisent pendant le transport (E. Dassa, O. Pellegrini).

2) Évolution des systèmes ABC

Nous avons constitué une base de données de séquences, de structures et de fonctions des systèmes ABC (ABCISSE). Elle regroupe plus de 2650 ATPases de type ABC et plus de 7000 gènes quand on y ajoute leurs partenaires. Un outil d'annotation automatisé permet de prédire la fonction (rarement étudiée et inconnue dans la moitié des cas), la spécificité de substrat et les partenaires des ATPases (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/abc/database.html).

Nos analyses phylogénétiques répartissent les systèmes ABC en 3 classes qui recouvrent parfaitement les 3 classes fonctionnelles : les importeurs (exclusivement procaryotes), les exporteurs et les systèmes apparemment dépourvus de domaines transmembranaires qui seraient impliqués dans des phénomènes de régulation. L'analyse des systèmes ABC dans les génomes complets eukaryotes montre qu'ils ont conservé un jeu restreint de systèmes ABC en dépit de grandes différences dans la taille de leurs génomes. L'identification de 6 systèmes ABC typiquement procaryotes dans le génome nucléaire d'Arabidopsis thaliana suggère que les systèmes ABC eucaryotes descendraient essentiellement de bactéries symbiotiques, ancêtres des mitochondries et des chloroplastes (E. Dassa, L. Piloyan, P. Bouige).

3) Protéines ABC orphelines

Un nombre important de protéines ABC n'ont pas de protéines membranaires associées connues. La fonction de quelques-unes a été identifiée (régulation de la traduction, de la transcription ou réparation de l'ADN). Chez Staphylococcus aureus, Vga est impliquée dans la résistance aux streptogramines. Une collaboration avec les équipes de Névine El Solh, Jean-Luc Guesdon et Muriel Delepierre vise à en comprendre le mécanisme (Programme tranversal de Recherches N°55 coordonné par Olivier Chesneau). Quatre gènes d'Escherichia coli de la même famille, mais sans fonction connue, sont à l'étude (E. Dassa, D. Murat).

Troisième thème : Super-intégrons(Didier Mazel, Anne-Marie Guérout, Dean Rowe-Magnus, Latefa Biskri, Chiho Mashimo, Gaëlle Demarre)

Les transferts horizontaux de gènes jouent un rôle essentiel dans l'évolution des bactéries. On en trouve de nombreux exemples, allant de l'acquisition de nouvelles capacités métaboliques à l'expression de nouveaux facteurs de virulence chez les pathogènes. L'apparition et la dissémination des multi-résistances aux antibiotiques constatées ces dernières décennies posent de nombreux problèmes en santé publique. Elles illustrent dramatiquement l'importance de ces échanges génétiques.

Une classe particulière d'éléments mobiles, les intégrons, a joué un rôle primordial dans ce processus chez les bactéries à Gram négatif. Les intégrons constituent un véritable système de génie génétique naturel. Grâce à l'activité d'une intégrase spécifique de sites de recombinaison associés à chaque cassette, ils permettant la capture, l'expression et la dissémination d'ADN exogène.

Nous avons découvert une catégorie moins spécialisée d'intégrons, les super-intégrons, qui regroupent des dizaines de cassettes sur le chromosome de plusieurs g-protéobactéries (Vibrio, Shewanella, Xanthomonas, Pseudomonas...). Les relations phylogénétiques entre les intégrases des super-intégrons indiquent qu'ils dérivent d'un intégron hébergé par l'ancêtre commun de ces bactéries. Les super-intégrons ont ainsi pu jouer un rôle de machine évolutive pendant des centaines de millions d'années. Actuellement, ils maintiennent un réservoir considérable de fonctions adaptatives variées (métabolisme, résistances, détoxification, virulence...). Ils semblent capables de capturer des gènes d'origine extrêmement diverse, puisque certains n'ont pour l'instant d'homologues que chez les eucaryotes, les archaebactéries ou les virus. Nos études suggèrent que les super-intégrons sont à l'origine des intégrons multi-résistants. Nos travaux portent sur l'inventaire de ces éléments et l'analyse des fonctions qu'ils hébergent, sur l'expression des gènes à l'intérieur de ces structures et sur les mécanismes de recombinaison et de genèse des cassettes (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/integ/index.html)

Quatrième thème. Effets mutagènes d'agents de l'environnement (Philippe Quillardet, Eliette Touati, Xavier Arrault, Valérie Michel, Marie Ange Rouffaud)

Nous participons à la démarche préventive qui consiste à détecter les produits de l'environnement (les génotoxiques) capables de créer des mutations susceptibles d'entraîner des cancers chez l'homme. Nous avons créé le SOS-chromotest, un test colorimétrique bactérien pour le dépistage rapide des génotoxiques. Il a été validé sur un grand nombre de substances (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/toxic/index.html).

1) Mécanisme d'action des nitrofurannes chez Escherichia coli

La nitrofurantoine et le nifuroxazide, deux molécules mutagènes chez les bactéries, sont couramment prescrites contre les infections urinaires et gastrointestinales. Le R7000 (de la même famille des 5-nitrofurannes) est un des mutagènes les plus puissants pour les bactéries. Nous avons analysé les adduits que le R7000 crée massivement (essentiellement sur les guanines) et les mutations qui en résultent (substitutions G:C-›T:A et délétions d'une paire G:C). Une activation métabolique par des nitroréductases est nécessaire et entraîne un stress oxydatif, SoxRS-dépendant, qui pourrait renforcer la génotoxicité des nitrofurannes (P. Quillardet, E. Touati, X. Arrault, V. Michel, M-A. Rouffaud).

2) Mécanisme d'action des nitrofurannes chez la souris

Les effets des nitrofurannes ont été étudiés dans un modèle animal (souris transgéniques "Big Blue" hébergeant un gène rapporteur bactérien) pour évaluer les conséquences possibles de l'utilisation des nitrofurannes chez l'homme. L'injection du R7000 par voie intrapéritonéale induit essentiellement des mutations au niveau du petit intestin, du caecum et du colon, cibles de l'action thérapeutique des nitrofurannes. Ces mutations, et donc probablement le mode d'action du R7000, sont très similaires chez la souris et chez E. coli. L'administration orale de R7000 ou de nitrofurantoine entraîne respectivement des mutations au niveau de l'estomac ou des reins. Aucune activité mutagène n'est par contre détectée avec le nifuroxazide (P. Quillardet, E. Touati, X. Arrault, V. Michel, M-A. Rouffaud).

3) Génotoxiques et transcriptome

Le transcriptome d'Escherichia coli nous permet d'identifier les gènes induits ou réprimés par une grande variété d'agents génotoxiques (en particulier dans les polluants du milieu naturel) et de définir une "signature" pour chacun d'eux. Leur action sur le métabolisme, leur activation et sur les réponses réparatrices pourra être précisé ainsi que les propriétés d'ORF dont la fonction est actuellement inconnue. D'autre part, la construction de souches bactériennes portant des fusions entre des gènes diagnostiques et un gène rapporteur permettra la mise au point d'un test de dépistage rapide des agents génotoxiques de l'environnement (P. Quillardet, M-A. Rouffaud).

4) Bactéries et cancer

Une collaboration avec les équipes d'Agnès Labigne et de Michel Huerre (Programme Transversal de Recherche N°9 coordonné par Eliette Touati) vise à examiner pourquoi certaines maladies d'origine bactérienne peuvent à long terme évoluer en cancer. Helicobacter pylori, responsable des ulcères gastriques chez l'homme semble jouer un rôle majeur dans la genèse des cancers gastriques. Chez les souris transgéniques "Big Blue", une réaction inflammatoire de la muqueuse gastrique est visible après 6 mois d'infection chronique par H. pylori ou H. felis. La mutagenèse y est augmentée et le type de mutations induites par H. pylori suggère la formation de dommages oxydatifs sur l'ADN. Ce modèle constitue un outil puissant pour étudier différents paramètres, en particulier le rôle des effecteurs de la réaction inflammatoire sur la génotoxicité (E. Touati, V. Michel).

Figure: Distribution des BIME sur le chromosome d'Escherichia coli



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ARRAULT Xavier, Etudiant en thèse de Pharmacie

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MASHIMO Chiho, Chercheur Associé, CNRS

MURAT Dorothée, Etudiante en DEA

PILOYAN Linda, Etudiante en Maîtrise

ROWE-MAGNUS Dean, Boursier EMBO puis FRM

WILDE Caroline, Etudiante en thèse

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