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  Responsable : Philippe SANSONETTI (psanson@pasteur.fr)


  resume

 

Notre unité étudie les bases moléculaires, cellulaires et tissulaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière intestinale par les bactéries invasives et les mécanismes de défense et de protection contre ces infections. Notre modèle est Shigella, l'agent responsable de la dysenterie bacillaire. Nous appliquons une combinaison de génétique moléculaire, génomique fonctionnelle, biologie cellulaire, médecine expérimentale et immunologie. Nous identifions les gènes microbiens, la régulation de leur expression et leurs produits modifiant le comportement des cellules épithéliales ou phagocytaires de l'hôte. La signalisation conduit à l'internalisation du microorganisme, son mouvement intracellulaire et sa dissémination dans l'épithélium. La présence du microorganisme au sein de la cellule épithéliale et son interaction avec les cellules phagocytaires induit une cascade de signalisations pro-inflammatoires causant une rupture de la barrière épithéliale intestinale et son éventuelle destruction. L'influence de cette réponse immunitaire innée, sur la qualité de la réponse immunitaire spécifique, est aussi étudiée. Ces études fondamentales sont appliquées au développement de candidats vaccins contre la dysenterie bacillaire. Des essais cliniques de phase 1 et 2 sont actuellement en cours au Bangladesh avec une souche de virulence atténuée : SC602.



  rapport

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Génétique du phénotype invasif de Shigella flexneri Chercheur statutaire : Claude Parsot. Chercheurs post-doctorants : Maria Mavris, Kaïs Jamoussi. Doctorant : Anne-Laure Page. Ingénieur : Hélène d'Hauteville.

Les déterminants de l'entrée et de la dissémination des bactéries dans les cellules épithéliales sont codés par un plasmide de 213 kb, pWR100, dont la séquence et l'annotation ont été réalisées, en collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Micro-organismes Pathogènes. Ce plasmide contient, en particulier, une région de 30 kb qui spécifie un appareil de sécrétion de type III (l'appareil Mxi-Spa), des protéines sécrétées par cet appareil (les protéines IpaA-D, IpgB et IpgD) et des chaperons cytoplasmiques (IpgC, chaperon de IpaB et IpaC, et IpgE, chaperon de IpgD). L'appareil de sécrétion est activé lors du contact de la bactérie avec des cellules eucaryotes, ce qui induit la sécrétion des protéines IpaA-D et IpgB et IpgD. Le plasmide spécifie également une vingtaine d'autres protéines sécrétées par l'appareil Mxi-Spa (les protéines Osp et IpaH), certaines de ces protéines n'étant produites qu'en conditions de sécrétion.

Les travaux effectués cette année ont porté sur trois aspects principaux : 1) Le rôle des protéines Osp dans le pouvoir pathogène de S. flexneri a été abordé en utilisant une approche génétique consistant à inactiver les gènes correspondants et à caractériser le phénotype des mutants in vitro et in vivo ; 2) Les interactions entre protéines sécrétées et chaperons ont été analysées en utilisant la technique du double hybride dans la levure et des méthodes de copurification dans S. flexneri. Nous avons ainsi identifié les sites d'interaction de IpgC sur IpaB et IpaC et mis en évidence un nouveau chaperon, Spa15, qui est associé dans le cytoplasme aux protéines IpaA, IpgB et OspC ; 3) Le mécanisme du contrôle de la transcription des gènes osp et ipaH par l'activité de sécrétion a été élucidé et met en oeuvre un activitateur de transcription de la famille AraC, MxiE, dont l'activité dépend du chaperon IpgC.

Ces résultats fournissent un schéma sur la " logique " de fonctionnement de la voie de sécrétion de type III de S. flexneri. A 37°C, l'appareil Mxi-Spa est produit et assemblé sous une forme inactive. Les protéines IpaA-D et IpgB et IpgD, effecteurs de l'entrée des bactéries, sont également produites et stockées dans le cytoplasme de la bactérie, la plupart en association avec un chaperon spécifique. L'appareil de sécrétion est activé au contact de la bactérie avec la cellule, permettant la libération des invasines. Le chaperon IpgC est alors capable d'activer le régulateur MxiE, ce qui conduit à la transcription des gènes spécifiant une deuxième vague d'effecteurs, dont le rôle reste à analyser.

Molécules et signaux impliqués dans l'entrée de Shigella dans les cellules épithéliales et dans le passage de cellule à cellule.Chercheur statutaire : Guy Tran Van Nhieu. Chercheurs post-doctorants : Nalini Ramarao, Caroline Clair. Doctorant : Laurence Bougnères. Technicienne : Joëlle Mounier.

Nous étudions la cascade de signalisation qui cause les remaniements du cytosquelette cellulaire responsables de la formation du foyer de macropinocytose qui amène l'internalisation de Shigella dans les cellules épithéliales. Nous analysons plus particulièrement le rôle des petites GTPases de la famille Rho, Cdc42 et Rac et l'activation de la tyrosine kinase p60c-src. Ces deux voies de signalisation sont engagées simultanément durant l'entrée de Shigella dans la cellule, et nous avons récemment montré que la protéine IpaC, qui s'insère dans la membrane de la cellule épithéliale infectée, participe directement à l'activation de ces voies. Cdc42 et Rac sont responsables de la polymérisation de l'actine et de la formation des filopodes et lamellipodes qui entourent le corps bactérien, induisant son internalisation par la cellule. Les modalités de leur activation par IpaC sont en cours d'analyse. La polymérisation de l'actine en aval de ces GTPases, à distance du site d'interaction entre le corps bactérien et la membrane cellulaire fait intervenir la tyrosine phosphorylation de la cortactinepar p60c-src.

Nous avons par ailleurs démontré le rôle essentiel joué par les connexines dans le passage de cellule à cellule de Shigella. Nous tentons d'identifier les médiateurs transférés via les jonctions communicantes durant l'invasion de Shigella, qui facilitent la dissémination au sein de l'épithélium.

Bases moléculaires et cellulaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière épithéliale intestinale par ShigellaChercheurs statutaires : Philippe Sansonetti et Régis Tournebize. Chercheurs post-doctoraux : Dana Philpott, Stephen Girardin. Ingénieur : Thierry Pédron.

Dans le cadre de notre projet visant à comprendre comment Shigella assure l'invasion et la destruction inflammatoire de la barrière intestinale infectée, nous avons confirmé le rôle essentiel joué par la cellule épithéliale intestinale elle-même dans ce processus où l'IL-8, l'IL-1bet le TNFa jouent un rôle clé. La stratégie utilisée combine des approches in vitro et in vivo. Dans l'approche in vitro, nous avons identifié une protéine, Nod1, homologue chez les cellules de mammifères des protéines de résistance des plantes, qui agit en tant que senseur intracellulaire du LPS introduit par la bactérie invasive. Il semble que ce système original de signalisation soit l'équivalent cytosolique du système de signalisation trans-membranaire des Récepteurs " Toll-Like " (TLR). L'activation par oligomérisation de Nod1 en présence de LPS, via RICK, active les voies NF-kB et Jun-terminal kinase (JNK), déclenchant ainsi les propriétés pro-inflammatoires de la cellule infectée. Cette propriété est résumée par l'activation de la transcription et la production massive d'IL-8. Nous avons étudié globalement le transcriptome des cellules intestinales humaines infectées par Shigella par le système AFFYMETRIX et avons défini un profil transcriptionnel confirmant l'orientation essentiellement pro-inflammatoire de la signalisation induite par l'invasion. Dans un modèle in vivo, nous avons démontré l'importance du degré d'endotoxicité du lipide A dans la rupture de la barrière épithéliale. Ceci a pu être fait grâce à la mutagénèse de deux gènes msbB dont les produits assurent l'acylation complémentaire du lipide A. Il convient maintenant de relier les observations in vitro et in vivo. Nous développons pour ce faire des méthodes d'analyse en temps réel des processus infectieux basées sur l'IRM et la microscopie intraitable.

Immunité intestinale spécifique au cours de la dysenterie bacillaire.Chercheur statutaire : Armelle Phalipon. Chercheur post-doctoral : Maria-Isabel Fernandez-Martinez, Karine Le Barillec. Etudiante en DEA : Florence Rivenet. Technicienne : Audrey Thuizat.

Nous étudions les effecteurs de l'immunité protectrice au cours de la primo-infection et lors d'une ré-infection, ainsi que l'influence de la réponse innée inflammatoire sur la mise en place de l'immunité spécifique. En collaboration avec James Di Santo, nous avons montré, dans un modèle murin, que les lymphocytes NK et les lymphocytes TCD4+(a/b) contribuent l'un comme l'autre à l'éradication de la primo-infection via la production d'interféron g(INF-g). Aux étapes très précoces de l'infection, Shigella semble moduler la production d'INF-g.Ceci nous amène à étudier le rôle de la modulation de la réponse innée dans la mise en place de l'immunité humorale protectrice.

La réponse humorale dirigée contre la partie polyosidique du LPS (Ag-O) est essentielle dans la protection contre une ré-infection. Nous avons montré que la réponse médiée par des anticorps de type IgG spécifiques de l'Ag-O peut contribuer à la protection si cette réponse est initiée au niveau local, assurant ainsi la présence des effecteurs au site d'infection. Concernant les IgA sécrétoires (S-IgA) requises pour la protection de la muqueuse, nous avons montré, en collaboration avec Blaise Corthésy, que le composant sécrétoire est directement impliqué dans cette fonction de protection en assurant via ses résidus glycosylés une localisation tissulaire appropriée de l'IgA pour une fonction d'exclusion immune optimale. Par ailleurs, nous avons montré que le LPS bactérien absorbé par le pôle apical des cellules épithéliales activait NF-k B selon une cinétique plus lente que la bactérie invasive. Cette activation est neutralisée par une IgA monoclonale anti-LPS, qui au cours de sa transcytose, intercepte le produit bactérien. Ceci démontre un rôle anti-inflammatoire potentiel tout à fait original pour les S-IgA. Ainsi, la protection médiée par les IgA sécrétoires anti-LPS semble s'effectuer par un double mécanisme : exclusion immune des bactéries en surface de l'épithélium et neutralisation intracellulaire d'un produit bactérien pro-inflammatoire.

Vers un vaccin vivant oral atténué contre la shigellose.

Dans le cadre d'une collaboration avec le Walter Reed Army Institute of Research aux USA et l'ICDDR,B au Bangladesh, nous continuons les essais cliniques de phase I et II de la souche SC602 de S. flexneri 2a. Avec le soutien de la DGA, nous mettons en route l'étude de phase I de SC599, une souche candidate vaccinale atténuée de S. dysenteriae I. Par ailleurs, afin de limiter au maximum les effets secondaires, notre objectif est d'arriver à un vaccin pentavalent comportant 3 sérotypes de S. flexneri, S. dysenteriae1 et S. sonnei.

Légendes des photos :

Photo 1: Le plasmide de virulence pWR100 de 214 kb de Shigella flexneri.

Photo 2: Effets de l 'activité kinase de Src sur les modifications du cytosquelette au site d 'entrée de Shigella dans la cellule.
Des cellules HeLa sont infectées par Shigella et les modifications du cytosquelette induites lors de l 'entrée de la bactérie sont analysées par marquage immuno-fluorescent de la cortactine (rouge), de l 'actine filamenteuse (vert), ou du LPS bactérien (bleu). a-c: HeLa parentales; d-f: HeLa transfectées avec une forme dominante-négative de Src; g-i: HeLa transfectées avec une forme constitutivement active de Src.

Photo 3: Analyse in vivo du rôle du composant sécrétoire (SC) dans la protection médiée par les IgA sécrétoires à la surface muqueuse. Les IgA dimériques radioactives administrées par voie intranasale diffusent dans le tissu pulmonaire (a), mais se concentrent dans des zones restreintes quand liées au SC (b) (analyse au b-imager sur coupes histologiques de poumons). Ceci influe sur la localisation des bactéries (c et d) (bactéries exprimant la GFP). Le SC assure donc la localisation appropriée de l'anticorps pour une fonction d'exclusion immune optimale.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

JACQUEMIN Colette, cjacmin@pasteur.fr

PARSOT Claude, IP, Chef de Laboratoire, cparsot@pasteur.fr

PHALIPON Armelle, IP, Chargé de Recherche, phalipon@pasteur.fr

TRAN VAN NHIEU Guy, INSERM, DR2, gtranvan@pasteur.fr

TOURNEBIZE Régis, INSERM, CR2, tournebi@pasteur.fr

CLAIR Caroline, Stagiaire Post-doctorale

FERNANDEZ-MARTINEZ Maria-Isabel, Stagiaire Post-doctorale

GIRARDIN Stephen, Stagiaire Post-doctoral

JAMOUSSI Kaïs, Stagiaire Post-doctoral

MAVRIS Maria, Stagiaire Post-doctorale

PHILPOTT Dana, Stagiaire Post-doctorale

RAMARAO Nalini, Stagiaire Post-doctorale

BOUGNÈRES Laurence, Etudiante

GAMELAS MAGALHAES Joao, Etudiant

PAGE Anne-Laure, Etudiante

RIVENET Florence, Etudiante

d'HAUTEVILLE Hélène, Ingénieur, hautevil@pasteur.fr

PEDRON Thierry, Ingénieur, tpedron@pasteur.fr

MOUNIER Joëlle, Technicienne, jmounier@pasteur.fr

THUIZAT Audrey, Technicienne, athuizat@pasteur.fr


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