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  Pfme


  Responsable : Marie-Christine PREVOST (mprevost@pasteur.fr)


  resume

 

La plate-forme de microscopie électronique propose une activité orientée selon trois axes. Une activité de recherche et de développement de l'analyse ultrastructurale en biologie cellulaire, virologie et microbiologie sur différentes thématiques en collaboration avec les chercheurs du campus auquel s'ajoute une méthodologie plus spécialisée pour les immunomarquages à l'or colloïdal et les cryofixations. Une activité de services pour le contrôle de différents échantillons biologiques (cellules, cellules primaires, virus, bactéries, champignons) et une activité d'enseignement.



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La PFME (Plate-forme de microscopie électronique) permet d'offrir en priorité à la communauté pasteurienne, la possibilité d'effectuer des études et des travaux sur des sujets pour lesquels l'approche ultrastructurale aura un rôle essentiel dans la thématique de recherche. Le laboratoire est équipé de plusieurs microscopes électroniques à transmission (CM10, CM12 de chez Philips et JEM 1010 et 1200EX de chez Jëol) et prochainement d'un microscope électronique à balayage à haute résolution JSM-6700F avec une cathode à émission froide (Cold FEG) qui permet d'obtenir une résolution de 2 à 3 nm à 1KV pour des échantillons biologiques. Ce microscope sera installé au cours du premier semestre de l'année 2002. Le laboratoire offre un ensemble de matériels qui permet d'accomplir un éventail assez large de technique (www.pasteur.fr/pasteur/directions/pasteur-private/DETS/micro_electro.html) dans différents domaines pour la préparation des échantillons biologiques .

Le plateau technique aura également pour mission de former les techniciens, ingénieurs et chercheurs qui souhaitent s'impliquer à l'utilisation du matériel de façon autonome.

La plate-forme se proposera également de développer de nouvelles technologies et méthodologies dans des domaines plus pointus de l'analyse ultra structurale telle que les cryotechniques liées à la biologie cellulaire, en accord avec le conseil de stratégie d'orientation et le directeur des plates-formes technologiques.

Les travaux seront effectués sous forme de contrat de collaboration où les objectifs seront de définir le ou les projets avec les chercheurs où les deux parties s'engageront sur les possibilités, risques et orientation technologique ainsi que sur la confidentialité, les résultats et la reconnaissance extérieure. Ces collaborations pourront faire intervenir différents laboratoires et groupes de recherche.

C'est dans ce cadre que depuis la création de la plate-forme nous avons engagé des collaborations avec différentes unités du campus sur divers thèmes qui ont nécessité une approche en microscopie électronique aussi bien sur des techniques classiques, que sur des techniques plus spécialisées telles que les immunomarquages à l'or colloïdal avec différentes approches. (Cryocoupes, cryofixation et cryosubstitution).

Au cours de l'année 2001, les différents travaux de recherche ont porté sur différentes études :

Virologie et de Rétrovirologie :

Étude sur le VIH 

- Étude des voies d'entrée du VIH dans des cellules primaires (lymphocytes, macrophages et cellules dendritiques) et rôle de l'entrée par endocytose, phagocytose et macropynocytose. Pour cette étude nous utiliseront la microscopie ultrastructurale, l'immunomicroscopie et la microscopie électronique à balayage à haute résolution.

Collaboration avec le groupe d'Olivier Schwartz " Virus et Immunité ".

- Analyse structurale et localisation cellulaire du complexe de préintégration HIV muté ou non dans le DNA flap où nous avons déjà par microscopie électronique et immunogold visualisé des structures juste à l'extérieur des pores nucléaires et nous espérons visualiser la surface de noyaux purifiés également avec la microscopie électronique à Balayage à haute résolution qui nous permettra également de faire une analyse immunologique quantitative.

Collaboration avec le groupe de P.Charneau " Virologie moléculaire et vectorologie ".

- Caractérisation par immunomicroscopie de pseudo particules virales, en coloration négative et observation ultrastructurale classique en coupes.

Collaboration avec plusieurs groupes et unités (J.M.Heard de l'Unité Rétrovirus et Transfert Génétique ainsi que S.Chamsi (Pitié Salpêtrière) et P.Charneau.)

- Étude de l'interaction des particules HIV avec la nucléoline de surface et l'interférence du pseudopeptide HB-19.

Collaboration avec A.Hovanessian de l'Unité de Virologie et Immunologie Cellulaire.

Etude sur le CMV 

- Étude de L'infection par le CMV des cellules stromales myofibroblastiques, qui en augmentant l'adhésion des cellules CD34+ permet la transmission virale.

Collaboration avec S. Michelson de l'Unité d'Immunologie Virale.

-Mécanisme d'entrée du CMV humain dans des lignées épithéliales intestinales.

Collaboration avec S.Michelson et A.Esclatine de l'Unité U-150 à la Faculté de Pharmacie.

Etude sur le virus HTLV-1

- Mise au point d'un modèle murin d'infection par le virus chimérique HTLV/ MuLV. Dans cette étude, la microscopie électronique a permis de caractériser les particules de virus chimériques dans les surnageants de transfection et les cellules transfectées.

Collaboration avec F.Tangy. de l'unité des virus lents

- Contribution du motif PPPY des protéines GAG au bourgeonnement du rétrovirus HTLV-1.

Collaboration avec I.Leblanc, MC.Dokhélar et A.Rosenberg de l'Unité Insern U332 à l'Institut. Cochin.

Etude sur le virus de Theiler 

- Morphogenèse du virus de Theiler, souche DA et GD7 dans les cellules BHK-21.

Collaboration avec M.Brahic de l'Unité des Virus Lents

D'autre part des projets de collaborations sont en cours d'investigations pour la recherche et l'identification de particules virales dans des surnageants cellulaires et des contrats de collaborations ont été engagés avec l'Unité d'Epidémiologie Moléculaire des Entérovirus (F. Delpeyroux et A.Bukoska), l'Unité de Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires (L. Cohen) et l'Unité de Biologie des Infections Virales Emergentes (M.Zeller).

Bactériologie et Mycologie :

- Localisation des protéines chez Mycobacterium tuberculosis, mycobacterium bovis, BCG, et Mycobacterium segmatis après avoir identifié leurs implications dans la virulence et l'antigénicité avec différentes techniques et plus particulièrement leur localisation sub-cellulaire en immunomicroscopie.

Collaboration avec N.Honoré, A.Pym et S.Cole de l'Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne.

- Analyse morphologique de la germination des conidies d'Aspergillus fumigatus après phagocytose par des macrophages alvéolaires de différentes origines (souris, homme et lignée cellulaire).

-Morphologie de mutants de A. Fumigatus affectés dans la synthèse de la paroi et marquage immunocytochimique des polysaccharides pariétaux chez ces mutants.

- Localisation de synthéases et d'hydrolases intervenant dans la synthèse de la paroi cellulaire de A. Fumigatus.

Collaboration avec JP latgé de l'Unité des Aspergillus.

Pysiopathologie :

- Cytolocalisation des Antigènes Mycobactérien.

Collaboration avec O.Neyrolles et B. Gicquel de l'Unité de Génétiques des Mycobactérie

Des contrats de collaboration ont été également engagés pour l'unité de pathogénie bactérienne des muqueuses d'A. Labigne.

Un travail d'analyse ultrastructurale a également été fait pour la caractérisation des cellules M de l'appendice de lapin.

Collaboration avec S.Kerneis-Golsteyn et E.Pringault du laboratoire des interactions Lympho-Epithéliales.

Immunologie:

Effet des antigènes salivaires de moustiques sur la dégranulation mastocytaire et le rôle dans la facilitation de l'infection par plasmodium chez la souris.

Collaboration avec S. Mecheri de l'Unité d'Immunoallergie.

Collaborations extérieures au campus :

-Rôle des mitochondries dans l'apoptose et localisation des protéines impliquées par immunomarquage à l'or colloïdal.

Avec C.Brenner du C.N.R.S UMR6022. Université de Compiègne.

-Identification et cytolocalisation des antigènes de surface chez Mycoplasma penetrans.

Avec A.Balanchard de l'INRA. Bordeaux.

Activités de service :

Contrôle de différents échantillons biologiques (virus, lignées cellulaires primaires et continues, bactéries et champignons). Ces analyses sont entreprises pour les unités du campus qui ont besoin de ces contrôles afin de poursuivre leurs investigations de recherche. Nous avons également une activité d'expertise pour Texcell et pour des organismes extérieurs au campus (AFSSA) qui se terminera au mois de Janvier 2002.

Activités d'enseignement :

Les différentes techniques de microscopies sont enseignées aux chercheurs, enseignants et techniciens des laboratoires qui souhaitent s'investir dans cette technologie et c'est dans cette optique que sera mis en place le cours de formation continue à l'Institut Pasteur.

 



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