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  Parmed


  Responsable : Pierre DRUILHE (druilhe@pasteur.fr)


  resume

 

Les activités de l'Unité s'organisent selon deux grands axes d'étude, celui des stades hépatiques et du stade mérozoïte de plasmodium , la principale nouveauté de l'année étant le début d'essais vaccinaux chez le volontaire sain et la mise en place d'autres essais cliniques pour l'année à venir.



  rapport

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I - Immunité contre les stades pré-érythrocytaires 

Nous avons apporté des preuves dans le passé que ce qui a été longtemps appelé immunité anti-sporozoïte était en fait lié au développement de trophozoïtes intra-hépatiques, ce qui a nous conduits à développer des méthodes d'étude de ces stades longtemps oubliés. Nous avons, au cours de l'année 2001, complété la caractérisation des gènes exprimés au cours de la phase intra-hépatique du parasite humain P. falciparum dans des hépatocytes humains, portant aujourd'hui à 29 le nombre d'antigènes caractérisés à ces stades dont on a longtemps pensé qu'ils n'en exprimaient qu'un seul, la Circum Sporozoïte proteine.

Parallèlement au développement pré-clinique et clinique de la molécule leader, LSA-3, nous avons cette année obtenu des indications en faveur de l'intérêt vaccinal de trois nouvelles molécules, deux par criblage différentiel de lymphocytes de volontaires immunisés par sporozoïtes irradiés, les uns protégés, les autres non, et le troisième par immunisation de souris et challenge par le plasmodium de rongeurs P.yoelii en tirant parti d'épitopes communs aux deux, ainsi que par immunisation de singes Aotus en Colombie et challenge par le parasite humain P. falciparum (brevets IP).

Nous avons mis au point un modèle d'étude in situ des réponses épitope-spécifique au niveau intra-hépatique et, avec ce modèle, avons entrepris une étude comparative des réponses locales vs périphériques. Les premiers résultats fournissent déjà des clés essentielles au développement vaccinal contre des pathogènes intra-hépatiques, principalement les virus des hépatites et les stades hépatiques du paludisme (Photo 1).

Nous avons poursuivi le développement pré-clinique de formulations dérivées du Liver Stage Antigen 3 (LSA-3) en utilisant 17 formulations Longs Peptides Synthétiques (80 — 160 AA) couvrant l'ensemble de la molécule de 200 kDa. Leur antigénicité pour les lymphocytes B et T a été analysée au Sénégal chez l'individu exposé au paludisme et leur immunogénicité, adjuvée par ASO2, chez la souris. Les résultats ont montré une exceptionnelle antigénicité quelle que soit la région de la molécule considérée et ont conduit au choix de 2 LSP qui ont été utilisés avec succès pour immuniser des singes Aotus en Colombie, qui ont été récemment challengés par des sporozoïtes de P. falciparum.

Nous avons contribué au développement d'un réseau d'étude des hépatocytes humains (soutenu par l'ARC) dans lequel divers modèles de transplantation de greffes xénogéniques humaines chez des souris immunodéprimées sont développés et, dans notre cas, en position ectopique extra-hépatique. Il a été possible d'obtenir la survie à 5 mois d'hépatocytes humains dont l'état fonctionnel est en cours d'investigation.

Nous avons entrepris de réexaminer de façon systématique les conditions de culture de plasmodium dans des hépatocytes in vitro, que nous avions initiées il y a de nombreuses années, et pu ainsi obtenir un accroîssement considérable du rendement qui ouvre aujourd'hui l'accès au transcriptome ainsi qu'au protéome de ces stades, les plus méconnus du cycle du paludisme et permettront aussi d'améliorer l'analyse des mécanismes de défense in vitro contre ces stades.

Nous avons contribué à mettre en évidence la régulation de l'expression stade-spécifique d'une famille multigénique, capable d'exprimer un répertoire de gènes au stade érythrocytaire et des répertoires distincts au stade sporozoïte ou au stade hépatique.

Nous avons mis en place en Thaïlande une nouvelle méthode d'analyse des mécanismes de protection contre le stade sporozoïte par génotypage des parasites émergents chez des individus ayant divers niveaux d'exposition au stade sporozoïte.

II — Stade érythrocytaire

Depuis la mise en évidence par des études immuno-cliniques du rôle dans la protection acquise chez l'homme d'un mécanisme médié par anticorps, monocyte-dépendant (ADCI), conduisant à la mise en évidence du rôle critique des anticorps cytophiles IgG1 et 3 et à la caractérisation de l'antigène MSP3, les travaux réalisés dans ce domaine restent dans cette logique et dans le droit fil de notre approche bio-clinqiue d'un vaccin antipaludéen.

Les résultats précédemment acquis nous ont conduits à initier le développement d'essais cliniques basés sur MSP3, notre premier essai a été réalisé de février à septembre 2001 avec une formulation Long Peptide Synthétique, adjuvée soit par l'alun, soit par le Montanide ISA720 qui a fait preuve d'une très bonne inocuité et immunogénicité et fourni des résultats tout à fait nouveaux, c'est à dire qui n'étaient pas prédits par les modèles pré-cliniques (rongeurs et primates).

Nous avons entrepris la caractérisation des divers épitopes B et T de la partie C-terminale, la plus conservée, de MSP3, identifié 7 épitopes B non cross-réactifs et entrepris l'étude de la fonction biologique des anticorps correspondants à chacun de ces épitopes, d'une part in vitro dans le test de coopération avec les monocytes (ADCI), d'autre part in vivo dans le modèle d'étude récemment développé de souris humanisées infectées par P. falciparum.

Nous avons analysé les données issues du projet génome de P. falciparum et observé la présence de 8 phases de lecture ouverte dans la région où se trouve MSP3, correspondant à une famille génique intitulée MSP3-1 à MSP3-8, qui a la caractérisque remarquable de posséder en commun les 3 épitopes B majeurs déjà identifiés dans MSP3 tandis que les autres régions de ces nouveaux gènes divergent considérablement de MSP3. La conservation de ces épitopes dans plusieurs gènes contigus plaide très fortement en faveur du rôle fonctionnel des épitopes communs.

Le nouveau modèle d'étude in vivo des stades érythrocytaires du paludisme humain chez la souris BXN, développé l'an dernier, a été exploité pour étudier l'effet biologique des anticorps correspondant à la majorité des candidats vaccinaux développés par d'autres groupes de par le monde, à savoir MSP-1, MSP-2, AMA1, RESA, EBA175, GLURP. Les résultats démontrent une absence totale d'effet biologique des anticorps dirigés contre chacune de ces molécules, à l'exception de GLURP, précédemment identifiée comme étant une cible du mécanismse d'ADCI (Photo 2).

Entretemps, nous avons étendu les études immuno-épidémiologiques précédemment menées en Afrique, dans un contexte génétique parasitaire et humain distincts, en Birmanie dans un village d'hyperendémie caractérisé précédemment. Dans ce set-up, les arguments immuno-cliniques précédemment collectés en faveur du rôle protecteur des anticorps anti-MSP3-Cterm et GLURP-N term ont été confirmés.

Nous avons achevé l'étude d'une série d'anticorps, dirigés contre l'antigène P. falciparum P126 appelé aussi SERA ou SERP, obtenus chez l'Aotus immunisé et challengé, d'anticorps monoclonaux ou d'anticorps humains immuno-absorbés sur diverses régions de cette molécule et ainsi mis en évidence que cette molécule était une troisième cible, après MSP3 et GLURP, du mécanisme de défence anticorps-dépendant, médié par monocytes (ADCI).

Cette année, nous avons achevé la construction d'anticorps recombinants humains contre l'épitope B majeur de MSP3, en collaboration avec M. Dziegel au Danemark, qui ont été exprimés sous formes d'isotypes IgG1 ou IgG3 et dont la capacité de bloquer le développement intra-érythrocytaire de P. falciparum a été démontrée en présence de monocytes in vitro. Ces anticorps recombinants pourraient être produits sous forme GMP pour compléter le traitement du neuropaludisme par la Quinine ou l'Artémisine.

Parallèlement, dans le cadre d'un projet CEDRE, nous avons développé un nouveau modèle d'immunisation in vivo de lymphocytes humains greffés chez des souris immunodéprimées, mis en évidence la possiblité d'obtenir une réponse primaire et secondaire chez des lymphocytes naïfs en utilisant la protéine MSP3-Cterm. Les bons résultats obtenus conduisent à examiner la capacité de ce modèle de prédire l'immunogénicité d'une formulation donnée chez l'homme, avant la phase clinique,.

Enfin, nous avons conduit une étude de chimiosensibilité de P. falciparum dans l'île de Mayotte par la nouvelle technique colorimétrique développée l'an dernier, qui a révélé un niveau tout à fait inhabituel de chimiorésistance à la majorité des composés disponibles, dans ce Territoire français.

Légendes des photos

Photo 1 : Etude des reponses epitope-specifique intra-hépatiques et typage des cellules par divers marqueurs de surface ou intra-cytoplasmiques

Photo 2 : Example de parasitémie obtenue dans le modèle P.falciparum Hu-GR-BXN, recevant successivement divers anticorps obtenus par immuno-adsorption sur divers candidats-vacccins



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Agathe HAMEG, Ingénieur de Recherche, ahameg@pasteur.fr

Jean-Pierre SAUZET, Ingénieur de Recherche, jpsauzet@pasteur.fr

Stéphanie HEZ, doctorant (Université de Rouen) shez@pasteur.fr

Subhash SINGH, doctorant (Université de Rouen)subhash@pasteur.fr

Ali Jaffarshad, doctorant (Paris VII) jaffarsha@pasteur.fr

Anne-Charlotte GRUNER (post-doc) gac@pasteur.fr

Simon WEISMAN (post-doc, boursier Cantarini) weisman@pasteur.fr

Catherine BLANC, Technicien, catblanc@pasteur.fr

Sophie CHAOUCHE, Technicien, chaouche@pasteur.fr

Nicolas PUCHOT, Technicien, npuchot@pasteur.fr

Danielle QUADOUR, Aide de laboratoire


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