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  Neisseria


  Responsable : Jean-Michel ALONSO (jmalonso@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de recherche de l'unité des Neisseria, Centre National de Référence des Méningocoques, sont centrés sur l'épidémiologie et la pathogénie moléculaires des infections à Neisseria meningitidis, incluant la caractérisation moléculaire des isolats cliniques impliqués dans les infections invasives (bactériémies et méningites) et notamment les clones épidémiques, en France et en Afrique. Les travaux expérimentaux portent sur l'analyse des mécanismes moléculaires d'adhésion et d'invasion bactériennes et de leur régulation in vivo, ainsi que des gènes de résistance aux béta-lactamines.



  rapport

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1.Surveillance des infections à N. meningitidis dans le cadre du CNRM (J-M Alonso, M-K Taha et coll ;).

N. meningitidis est un agent étiologique majeur de méningites (globalement 30% des méningites bactériennes aiguës) et de méningococcémies (septicémies), dans le monde entier. Outre les séquelles neurologiques, les infections méningococciques peuvent se compliquer de purpura fulminans et de choc septique mortel. Les infections méningococciques sont potentiellement épidémiques. L'incidence mondiale varie de 1 à 10/100000 selon les contrées, avec des taux de mortalité pouvant atteindre 10%. En France, l'incidence qui était stable à <1/100000 depuis 11 ans, connaît depuis 2000 un accroissement de plus de 20% par rapport à l'incidence moyenne sur les dix années précédentes. Les cas restent néanmoins sporadiques et il n'y a pas d'épidémie. La proportion des différents sérogroupes parmi les souches isolées d'infections invasives montre que le sérogroupe B reste dominant (55,7% contre 66% en 2000) malgré une augmentation du sérogroupe C, dont la proportion atteint 36,2%, contre 19,2% en 2000, le sérogroupe W135 (8%) et le sérogroupe Y (3,4%). Quarante-huit cas de méningococcies mortelles ont été recensés en France en 2001. Ces formes létales concernent essentiellement les enfants de moins de 5 ans et les adultes de plus de 70 ans.

2.Recherche expérimentale.

Nos recherches s'appuient sur les données du CNRM, grâce à des collaborations avec nos correspondants nationaux et internationaux et ont pour principaux objectifs de contribuer à la mise au point de techniques de diagnostic et typages rapides et fiables, et à l'analyse des mécanismes pathogéniques moléculaires et cellulaires de ces infections en fonction de leur évolution épidémiologique.

2.1.Épidémiologie moléculaire de N. meningitidis.

2.1.1. Diagnostic et typages moléculaires.

La caractérisation de N. meningitidis directement à partir des prélèvement biologiques (sang, liquide céphalo-rachidien, etc.) permet son identification par l'amplification du gène de régulation crgA, puis la prédiction du sérogroupe de la souche incriminée, par l'amplification du gène siaD de la biosynthèse de la capsule (sérogroupes B, C, Y/W135) ou l'amplification de mynB  impliqué dans la biosynthèse des polyosides capsulaires du sérogroupe A. Ces méthodes permettent d'obtenir un diagnostic spécifique rapide et fiable même lorsque la culture de la souche s'avère impossible. Le typage moléculaire de N. meningitidis permet d'identifier une filiation entre différents cas épidémiques. Nous exploitons le polymorphisme de cinq loci chromosomiques: les gènes pilA, pilD, crgA, regF et iga. Ceux-ci sont amplifiés par PCR, puis analysés par "multilocus DNA fingerprinting". Différents allèles de ces gènes sont ainsi individualisés, spécifiques de chaque groupe clonal. Cette technique, parfaitement corrélée à la "multilocus enzyme electrophoresis", et complétée par l'éléctrophorèse en champs pulsé et le " multilocus sequence typing " nous a permis de caractériser plusieurs foyers d'infections méningococciques en France, confirmant une situation endémique due des génotypes hétérogènes.

2.1.2. Mise en évidence du rôle de N. meningitidis W135 lors de l'épidémie 2001 en Afrique sub-saharienne.

Cette approche de diagnostic et typages moléculaires des agents de méningite a été appliquée à l'identification des causes d'une importante épidémie de méningite en Afrique sub-saharienne en 2001. Au premier trimestre 2001, une épidémie de méningite entraînant une mortalité élevée touchait les pays du Sahel. Le Burkina Faso et le Niger étaient parmi les pays les plus gravement atteints par l'épidémie, avec 13039 cas, dont 1813 mortels, et 7906 cas, dont 595 mortels, respectivement. Une mission organisée en urgence, en collaboration avec l'Association pour l'aide à la Médecine Préventive, du 17 au 23 avril 2001au Burkina Faso et au Niger a permis de collecter, en fin d'épidémie, 98 échantillons de patients souffrant de méningite.

Les échantillons de liquide céphalo-rachidien (LCR) ou de sérums ont été testés par PCR pour la détection d'ADN de Streptococcus pneumoniae (Sp), de N. meningitidis(Nm)ainsi que d' Haemophilus influenzae type b (Hib). Les échantillons positifs pour Nm ont fait l'objet d'une caractérisation des gènes de capsule par PCR permettant de prédire les sérogroupes A, B, C, Y et W135. Parmi les 58 échantillons du Burkina Faso, 32 (55%) étaient positifs pour Nm, 4 pour Sp et 22échantillons furent négatifs pour les trois agents recherchés. Parmi les 40 échantillons du Niger, 31 (78%) étaient positifs pour Nm, 3 pour Sp, 2 pour Hib et 4 échantillons furent négatifs. Parmi les 32 échantillons du Burkina Faso positifs pour Nm, 8 correspondaient au sérogroupe A,12 au sérogroupe W135 et 2 au sérogroupe C.LaPCR ne permit pas de prédire le sérogroupe de Nm de 10 échantillons.Parmi les 31 échantillons du Niger positifs par PCR pour Nm, l'amplification par PCR des gènes de capsule de Nm permit de détecter 16sérogroupes A, 12 sérogroupes W135 et 1 sérogroupe C, alors que dans 2 échantillons le sérogroupe ne put pas être identifié. Ainsi, parmi les échantillons positifs pour Nm pour lesquels le sérogroupe put être prédit, 38 % correspondaient au sérogroupe W135, 38% correspondaient au sérogroupe A, et 5% au sérogroupe C. De plus, 12 souches de N. meningitidis avaient été isolées d'autres échantillons de LCR (4 au Burkina Faso et 8 au Niger). Parmi les 4 souches du Burkina Faso, une seule était de formule antigénique A: 4: P1-9 alors que les 3 autres étaient W135:2a: P1-2,5. Parmi les 8 souches du Niger, 7 étaient de formule antigénique A: 4: P1-9 et 1 était W135:2a:P1-2,5. Cette enquête de terrain révélait donc l'implication du sérogroupe W135 en proportion équivalente à celle du sérogroupe A de N. meningitidis en situation épidémique, alors que la campagne de vaccination A&C était entreprise depuis plusieurs semaines. Les hypothèses pouvant expliquer cette possible "épidémisation" du W135 évoquent, comme dans le cas des souches W135 associées au pèlerinage de La Mecque 2000 avec lesquelles nous n'avons cependant pas d'évidence d'une similitude, un " shift " antigénique en fin d'épidémie et/ou la sélection d'un variant d'échappement à la vaccination A & C.

2.2. Polymorphisme du gène penA et sensibilité diminuée à la pénicilline.

Nous avons recensé dès 1994, une proportion importante de souches de sensibilité diminuée au seuil de 0,125mg/L (atteignant 30%). Dans une étude du polymorphisme du gène penA sur 25 souches de N. meningitidis, incluant 13 souches sensibles à la pénicilline (CMI< 0,125 mg/l) et 12 souches de sensibilité diminuée (1 mg/L> CMI ³ 0,125 mg/l), d'origines géographiques, de phénotypes (sérogroupe, sérotype, sous-type) et de sites de prélèvements différents, nous avons observé que pour des génotypes différents, définis d'après les profils de restriction des gènes pilA, pilD, crgA, regF et igaA, les souches dont la CMI de la pénicilline G était inférieure à 0,125 mg/L (penS) portaient un allèle du gène penA identique, alors que les gènes penA des souches présentant des CMI supérieures (penI) avaient des séquences remaniées. La transformation de souches penS en souches penI a été obtenue par transformation in vitro avec l'ADN total ou avec les produits d'amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) des gènes penA de souches penI ou par co-culture de souches des deux génotypes, suggérant une corrélation unique entre les altérations de penA et l'expression d'une moindre sensibilité à la pénicilline. La détection de telles altérations génomiques est désormais réalisable directement à partir des produits pathologiques, sans culture préalable, et complète donc le diagnostic et le typage moléculaires.

2.3. Génétique de la virulence de N. meningitidis.

L'adhésion des bactéries aux cellules épithéliales puis endothéliales constitue une phase cruciale des méningococcies. Les pili sont les principaux facteurs d'adhésion de N. meningitidis. La protéine PilC1 joue un rôle majeur dans l'assemblage des pili ainsi que dans l'adhésion aux cellules. Le gène pilC1 possède une région promotrice spécifique nécessaire à l'induction de l'expression de ce gène lors du contact bactéries/cellules. Un nouveau régulateur transcriptionnel a été identifié, le gène crgA de la famille de lysR, de N. meningitidis, et dont l'expression est induite par le contact avec la cellule cible en même temps que pilC1. Ce gène semble intervenir dans le contrôle de plusieurs gènes impliqués dans l'adhésion bactérienne aux cellules cibles et en particulier lors de l'adhésion intime des bactéries à la cellule.

Ces déterminants d'adhésion jouent également un rôle important aux étapes d'invasion des vaisseaux sanguins par l'activation du TNFa dans les cellules endothéliales en présence de monocytes.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Pascale Vienne

Jean-Michel ALONSO, IP

Muhamed-Kheir TAHA, IP

Mireille LARRIBE, Université Paris 7

Aude ANTIGNAC, doctorant Paris 7.

Al Eddine DEGHMANE, doctorant Paris 11.

Maria Leticia ZARANTONELLI, post-doctorante, Argentine

Magaly DUCOS,Technicienne supérieure,IP.

René PIRES,Technicien supérieur,IP.

Annie GUIYOULE, Technicienne supérieure, IP.

Dario GIORGINI,Technicien supérieur,IP


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