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  Responsable : WANDERSMAN Cécile (cwander@pasteur.fr)


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Le fer est un cofacteur essentiel pour de nombreuses réactions enzymatiques, mais peu soluble. Pour satisfaire leur besoin en fer, les bactéries ont de nombreux systèmes pour le solubiliser et le séquestrer. Ainsi, de nombreuses espèces bactériennes utilisent l'hème libre ou lié à des hémoprotéines, soit à l'aide de récepteurs de surface qui fixent directement la source d'hème, soit à l'aide de protéines extra cellulaires appelées hémophores capables d'extraire l'hème avec une très grande affinité et de le délivrer à un récepteur membranaire. Les hémophores forment une famille unique d'hémoprotéines dont la structure tridimensionnelle a permis d'identifier les résidus ligand axiaux du fer. Leur mutagénèse dirigée a mis en évidence un nouveau mécanisme de coordination de l'hème. L'apo-hémophore et l'holo-hémophore se fixent avec la même affinité et au même site sur leur récepteur de membrane externe. Pour expliquer le transport de l'hème, nous proposons un nouveau mécanisme de transfert d'hème depuis un hémophore chargé à un hémophore vide fixé sur le récepteur sans échange des hémophores .

Nous utilisons les hémophores (HasA) comme protéines modèles pour l'étude de la sécrétion des protéines dépourvues de peptide signal par les ABC transporteurs. L'interaction entre le signal de sécrétion C-terminal de HasA et l'ABC protéine induit la formation d'un complexe multiprotéique comprenant la protéine ABC, une ATPase très conservée et deux protéines auxilliaires de l'enveloppe. La protéine chaperone SecB permet l'adressage de l'extrémité N-terminal du polypeptide naissant vers la protéine ABC. En l'absence de SecB ou bien du transporteur, la protéine HasA s'accumule sous une forme active qui n'est plus compétente pour une sécrétion ultérieure. Cette forme repliée n'en est pas moins capable d'interagir avec le transporteur et d'inhiber la sécrétion de molécules nouvellement synthétisées. Ainsi, nous arrivons à un modèle paradoxal ou une protéine possédant un signal C-terminal est sécrétée de façon cotraductionnelle.

Notre dernier sujet concerne le rôle des pili conjugatifs dans la formation des biofilms.



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Nous avons actuellement trois sujets majeurs de recherche. L'un concerne les systèmes d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophores. Le deuxième concerne la sécrétion des protéines chez les bactéries à Gram négatif par la voie ABC. Et le troisième la génétique de la formation des biofilms.

1) Systèmes d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophores (Sylvie Létoffé, Laurent Debarbieux, Julie Deleule, Laurent Courtes, Sylvia Rossi, Philippe Delepelaire, Annick paquelin, Jean-Marc Ghigo)

Le fer, quoique très abondant, n'en est pas moins l'objet d'une guerre acharnée entre les organismes vivants, tous ayant des systèmes plus ou moins sophistiqués pour le solubiliser et le séquestrer. Le succès de l'infection et de la colonisation d'un hôte par un pathogène bactérien dépend donc pour beaucoup de l'issue de cette compétition pour le fer. L'étude des mécanismes d'appropriation du fer par les pathogènes bactériens est en plein essor dans de nombreux laboratoires dans l'espoir de de disséquer des étapes vulnérables du processus infectieux et de mettre au point de nouvelles drogues anti-bactériennes.

Il est actuellement bien établi que plusieurs systèmes d'acquisition de sources de fer peuvent coexister chez une même espèce. Ainsi, les microbes produisent des substances de petit poids moléculaire appelées sidérophores qui chelatent l'ion ferrique avec une très grande affinité et qui peuvent aussi extraire le fer des protéines porteuses de fer comme la transferrine ou la lactoferrine. Les sidérophores chargés sont internalisés à travers la membrane externe après fixation sur récepteurs spécifiques. Les bactéries ont aussi des récepteurs de surface qui reconnaissent directement les protéines porteuses de fer comme la transferrine ou la lactoferrine, et aussi des récepteurs spécifiques de l'hème et des hémoprotéines comme l'hémoglobine ou l'hémopexine. Par ailleurs, les bactéries sécrètent de petites protéines appelées hémophores qui fixent l'hème libre ou lié à des hémoprotéines avec une très grande affinité puis le retournent à des récepteurs spécifiques. Chez les bactéries à gram négatif, le transport à travers la membrane externe de ces sources de fer ou d'hème est dépendant de l'énergie dérivée de la force proton motrice et d'un complexe protéique de la membrane interne comprenant les protéines TonB, ExbB et ExbD. Le domaine périplasmique de TonB interagit avec une séquence conservée proche du N-terminus de ces divers récepteurs qui par ailleurs n'ont que peu de séquences communes.

Les hémophores aussi appelés HasA forment une nouvelle famille d'hémoprotéines sans homologie avec d'autres protéines connues. Ces hémophores que nous avons d'abord identifiés chez Serratia marcescens sont également présents chez d'autres espèces bactériennes (P. aeruginosa , Pseudomonas fluorescens et Yersinia pestis (Rossi et al manuscrit soumis). Leur rôle biologique est donc de capter l'hème de différentes hémoprotéines et de le délivrer à un récepteur spécifique HasR. Alors que le récepteur est indispensable à l'acquisition de l'hème, l'hémophore ne l'est pas, mais il optimise le système, réduisant la concentration minimale de substrat requise et élargissant le spectre des hémoprotéines substrats potentiels.

Nous avons caractérisé biochimiquement l'hémophore HasA de S. marcescens. C'est un monomère qui fixe une molécule d'hème avec une très grande affinité (10-11M) (Deniau et al manuscrit en préparation). La structure tridimensionnelle de l'holoprotéine a été déterminée montrant un seul domaine composé de 4 hélices a de 7 brins b organisés en feuillets anti-parallèles. Le site de fixation de l'hème est très exposé au solvant et est formé par deux boucles flexibles avec une histidine (32) et une tyrosine (75) comme ligands axiaux du fer ferrique. Une deuxième histidine (83) pourrait aussi être impliquée dans la fixation de l'hème. La mutagénèse dirigée de ces 3 résidus en alanine nous a permis de construire les simples, doubles et triples mutants et de déterminer le rôle de chaque résidus dans la fixation de l'hème. La tyrosine 75 joue un rôle central et l'histidine 83 est un ligand de l'hème en l'absence des deux autres résidus. Nous avons également montré qu'aucun de ces résidus n'est impliqué dans l'interaction avec le récepteur.

Les interactions entre l'hémophore et son récepteur ne se font pas par l'hème, mais impliquent une interaction proteine-proteine. L'apo et l'holo-hémophore se fixent avec des affinités semblables (5nM) sur le récepteur à un même site ou à des sites chevauchants (Létoffé et al, Mol. Microbiol. In press). Ceci nous conduit à proposer un nouveau mécanisme pour le transport de l'hème où il n'y aurait pas d'échange entre hémophores chargés et vides sur le récepteur, mais échange d'hème entre des hémophores chargés et des hémophores vides fixés sur leurs récepteurs. Les hémophores libres faisant la navette pour apporter l'hème aux hémophores fixés. Ce mécanisme d'échange de ligand pourrait avoir une portée générale et se produire aussi dans le fonctionnement des sidérophores.

On ne connaît pas encore les domaines du récepteur et de l'hémophore responsable de leur interaction. Nous les recherchons par des approches génétiques et biochimiques. Le complexe HasA-HasR a été purifié en grande quantite par chromatographie d'affinité en utilisant un hemophore portant une étiquette de polyhistidine. Les essais de cristallisation sont effectués par une étudiante du laboratoire en stage à Constance en Allemagne.

Alors que l'interaction entre hémophore et récepteur est indépendante de la protéine TonB, l'internalisation de l'hème est TonB-dépendante. S. marcescens possède un gène homologue à tonB localisé dans l'operon has appelé hasB. Les gènes hasB et tonB ont des fonctions redondantes seulement pour l'acquisition de l'hème. TonB est indispensable à l'acquisition des autres sources de fer complexé à des sidérophores. HasB est donc une protéine TonB spécifique qui ne pourrait interagir qu'avec le récepteur HasR (Paquelin et al, manuscrit soumis). Des homologues de TonB plus ou moins spécifiques ont également été identifiés chez Vibrio et chez P.aeruginosa .

L'opéron has de S. marcescens hasRADEB comprend les gènes codant pour le récepteur, l'hémophore, deux des trois protéines permettant la sécrétion de l'hémophore et un analogue de TonB. Il est réprimé par Fur en présence de fer. Juste en amont se trouve deux gènes hasI et hasS codant pour des protéines homologues aux facteurs ECF et à leurs régulateurs.

Des fusions transcriptionnelles entre les gènes has et-lacZ ont été construites et insérées par recombinaison homologue dans l'opéron has chromosomique de souches isogéniques lac- hasA- et lac- hasA+ de S. marcescens. L'hémoglobine utilisée comme source d'hème dans ces expériences induit la fusion hasR-lacZ de la souche hasA+ mais pas de la souche hasA- et ceci uniquement en carence en fer. L'addition d'hémophore purifié chargé ou non d'hème à la souche hasA- qui ne produit pas d'hémophore endogène nous a permis de montrer que seul l'hémophore chargé d'hème induit la fusion (Rossi et al, manuscrit en préparation).

Ainsi, nous montrons que les systèmes d'autorégulation des récepteurs par leurs ligands ne s'adressent pas qu'aux sidérophores et que l'inducteur et la molécule transportée sont des entités distinctes puisque l'hémophore n'est pas internalisé avec l'hème. Ce système de transduction depuis le milieu extra cellulaire jusqu'au cytoplasme comporte donc une étape supplémentaire, la protéine extracellulaire. En l'absence de source d'hème, en carence en fer, la bactérie produirait un niveau faible d'hémophore chargé en quelque sorte de la surveillance de la teneur en hème du milieu.

2) La sécrétion des protéines chez les bactéries à Gram négatif par les transporteurs ABC ( Guillaume Sapriel, Laurent Debarbieux, Philippe Delepelaire)

Les hémophores sont notre système modèle pour étudier la sécrétion des protéines dépourvues de peptide signal N-terminal par les ABC exporteurs.

Les bactéries à Gram négatif sécrètent une grande variété de protéines qui atteignent le milieu extra cellulaire par quatre voies de sécrétion numérotées de I à IV. Alors que la voie de sécrétion de type II dépend d'un peptide signal, et implique un mécanisme universel de translocation des protéines à travers les membranes plasmiques, les voies de sécrétion de type I et III en sont indépendantes. Pour la voie IV, des résultats contradictoires ne permettent pas d'aboutir pour l'instant à une conclusion.

La voie de sécrétion de type I encore appelée voie ABC est caractérisée par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire ayant un domaine de fixation de l'ATP appelé ABC (pour ATP Binding Cassette) très conservé. Ces protéines ABC forment une des plus grandes familles de protéines du monde vivant. Présentes aussi bien dans les membranes plasmiques que dans les membranes d'organelles, elles interviennent dans toutes sortes de transports parfois essentiels à la survie de l'organisme, comme le montre la liste sans cesse plus longue des maladies génétiques graves liées à des altérations de protéines ABC. De plus, de nombreuses protéines ABC constituent des pompes d'efflux pour différentes substances utilisées comme agents thérapeutiques (antibiotiques, drogues antimitotiques et métaux lourds).

Notre équipe a contribué à montrer que cette voie de sécrétion est présente chez plusieurs espèces bactériennes, qu'elle permet la sécrétion de protéines très diverses ayant toutes un signal C-terminal d'environ 50 acides aminés et que les transporteurs comprennent outre la protéine ABC, deux autres protéines de l'enveloppe bactérienne (appelées MFP pour Membrane Fusion Protein et OMP pour Outer Membrane Protein). Le signal de sécrétion sur l'exoprotéine reconnaît la protéine ABC dont l'activité ATPasique est modulée par cette interaction. Cette interaction "in vivo" induit la formation d'un complexe multiprotéique, comprenant les 3 protéines de sécrétion.

Les chaperons cytoplasmiques tels que SecB sont nécessaires au processus de sécrétion en guidant le N terminus du polypeptide naissant vers la protéine ABC (Sapriel et al soumis).. En l'absence de SecB ou bien du transporteur, la protéine HasA s'accumule sous une forme active qui n'est plus compétente pour une sécrétion ultérieure. Cette forme repliée n'en est pas moins capable d'interagir avec le transporteur et d'inhiber la sécrétion de molécules nouvellement synthétisées (Debarbieux et al soumis). Ainsi, nous arrivons à un modèle paradoxal ou une protéine possédant un signal C-terminal est sécrétée de façon cotraductionnelle.

3) Bases moléculaires de la formation de biofilms chez les bactéries à gram-négatif (Jean-Marc Ghigo)

Les populations de microorganismes qui se développent associées aux surfaces rencontrées dans les biotopes naturels ou artificiels sont appelées biofilms. En appliquant des méthodes essentiellement génétiques nous nous proposons d'identifier les facteurs cellulaires essentiels pour la formation d'un biofilm. L'objectif poursuivi à long terme est de contribuer à une meilleure compréhension des stratégies utilisées par les bactéries pour se développer et se maintenir en tant que populations fixées sur un substrat.

a) Développement du modèle expérimental

En utilisant les micro-fermenteurs du laboratoire des Fermentations de l'Institut Pasteur, Jean-Marc Ghigo a développé un modèle de production de biofilm en culture continue qui repose sur l'utilisation d'une batterie de microfermenteurs dans lesquels sont insérées des spatules sur lesquelles se développe le biofilm.

b) Rôle des pili de conjugaison dans la formation des biofilms

L'introduction de différentes souches d'E. coli dans le système expérimental décrit ci-dessus a révélé que les souches portant le plasmide conjugatif F présentent une très forte capacité à former un biofilm. La recherche par mutagenèse dirigée du facteur responsable de cette adhésion a permis de mettre en évidence le rôle joué par l'expression du poil conjugatif qui, en permettant la formation d'un réseau tridimensionnel, favorise la formation d'un biofilm épais.

L'examen de plus de trente plasmides conjugatifs naturels appartenant à des groupes d'incompatibilité très divers met en évidence que cette propriété n'est pas restreinte au plasmide F, mais est généralisable à l'ensemble des très nombreux plasmides conjugatifs identifiés dans les populations naturelles de bactéries à Gram-négatif. Par ailleurs le contact de populations planctoniques réprimant l'expression des fonctions de conjugaison avec des bactéries présentes sur la surface induit la dérepression de ces fonctions qui aboutit au transfert horizontal du plasmide conjugatif lors de la formation du biofilm .

La relation entre conjugaison et capacité à former un biofilm mis en évidence par cette étude a de profondes conséquences écologiques. Elle suggère en particulier que les plasmides conjugatifs, en exprimant des fonctions d'adhésion, favorisent l'accès de leurs bactéries hôtes aux biofilms. Ceux-ci, de par leur constitution hautement héterospécifique, pourraient ainsi constituer un micro-environnement très favorable à la transmission horizontale de matériel génétique, phénomène considéré comme un mécanisme essentiel d'acquisition de nouveaux traits génétiques.

c) Identification de réponses physiologiques spécifiques du biofilm (Etude comparée du transcriptome en phases biofilm et planctonique)

La constatation que les populations bactériennes qui se développent sur une surface solide présentent des propriétés biologiques distinctes de leurs équivalents planctoniques (résistance accrue aux antibiotiques, morphologie distincte) suggère une réponse physiologique spécifique de la part des bactéries du biofilm.

Jean-Marc Ghigo a utilisé les macroarrays commercialisés par la firme Genosys pour le génome d'E. coli (E. coli panorama DNA array) pour réaliser l'analyse comparative des profils d'hybridation de bactéries cultivées en phase Biofilm et planctonique. Ce travail à conduit à l'identification d'un nombre relativement restreint de gènes. En utilisant une méthode d'inactivation rapide développée au laboratoire, l'analyse fonctionnelle de ces candidats a débuté sur la base du phénotype d'adhésion après inactivation ou surexpression des candidats testés.

Légendes des photos :

Photo 1 : Structure tridimensionnelle de HasA

Photo 2 : Le système Has de S. marcescens



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

MEUNIER Yolande, Secrétaire de Direction IP

DELEPELAIRE Philippe, DR2 CNRS

GHIGO Jean-Marc, Chargé de recherche I.P.

WANDERSMAN Cécile, Chef de Laboratoire I.P.

DEBARBIEUX Laurent, IP / Boursier Roux

HUCHET Frédéric, Etudiant doctorat /Boursier Université Constance

ROSSI Maria-Silvia, Stagiaire brésilienne, étudiante Doctorat Université Paris 7

SAPRIEL Guillaume, Etudiant Doctorat Université Paris 7

LÉTOFFÉ Sylvie, Ingénieur posit. 1 I.P.

PAQUELIN Annick, TCN CNRS

Cuisine : (commun Unité de Biochimie Microbienne et Unité Microbiologie et Environnement)

GUICHARD Fernande, Agent de Laboratoire I.P.

LEBON Gisèle, Aide de Laboratoire I.P.

MALBERT Marie-Jeanne, Aide de Laboratoire I.P.

RAJARATNAM Thomas, Responsable de préparation I.P.

Administratif : (commun Unité Microbiologie et Environnement)

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