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  Responsable : Véronique Vincent (vvincent@pasteur.fr)


  resume

 

De nouveaux outils génétiques et immunologiques ont été décrits au sein du laboratoire : plasmides linéaires répliqués dans des bactéries à croissance lente ou rapide, caractérisation d'isolats de M. africanum, démonstration que la mannosylation de certaines protéines est déterminante pour leur antigénicité. Ces molécules spécifiques sont utilisées pour mettre au point de nouvelles techniques de diagnostic de la tuberculose



  rapport

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Centre National de Référence (Gilles Marchal, Véronique Vincent, Cristina Gutierrez-Perez, Anne Varnerot, Maria de Moura Goncalves, Jean Sautereau, Cyril Depozat)

Le Laboratoire est Centre National de Référence des Mycobactéries et est à ce titre impliqué dans la surveillance épidémiologique de la tuberculose et des autres infections mycobactériennes. Le typage moléculaire de M. tuberculosis a permis de résoudre des cas de suspicion de transmission inter-patients nosocomiale ou communautaire ou de suspicion de contamination de laboratoire, impliquant en particulier des souches multi-résistantes aux antibiotiques. En collaboration avec l'Institut Pasteur de Lille, nous avons évalué l'intérêt épidémiologique du polymorphisme des MIRUs, loci de variations en tandem, pour le typage de M. tuberculosis grâce à une méthode rapide et de réalisation facile.

Le CNR a contribué à la caractérisation de la série épidémique de 58 cas de spondylodiscites à M. xenopi, consécutifs à des interventions du rachis dans une clinique chirurgicale. L'eau du réseau utilisée pour rincer les instruments après désinfection a été identifiée comme source épidémique. Dans un CHU parisien, le typage moléculaire a permis de démontrer l'eau de fontaines réfrigérées comme source d'une pseudo-épidémie à M. gordonae.

Le CNR est l'un des coordinateurs du réseau européen de surveillance de la résistance aux antituberculeux mis en place par l'OMS. Le CNR a participé à l'élaboration des recommandations de l'OMS concernant les tests de sensibilité des antituberculeux de seconde ligne. Une vaste étude de la tuberculose multi-résistante au sein du réseau des Instituts Pasteur est en cours.

Epidémiologie moléculaire et phylogénie de M. tuberculosis (Cristina Gutierrez-Perez, Véronique Vincent)

L'exploitation d'une base de données constituée des spoligotypes, profils génomiques représentant le polymorphisme de la région DR, de souches de M. tuberculosis caractérisées au niveau mondial a été menée en collaboration avec l'Institut Pasteur de la Guadeloupe. L'analyse a montré quelques familles principales de distribution universelle et d'autres familles spécifiques de certaines régions géographiques, suggérant la persistance de clones ancestraux et l'émergence récente de familles comme le type Beijing.

Etude de plasmides linéaires (Corinne Le Dantec, Véronique Vincent, Mathieu Picardeau)

Notre laboratoire a décrit les premiers plasmides linéaires chez diverses espèces mycobactériennes. Il s'agit d'éléments en invertron dont les télomères présentent des séquences terminales inversées répétées et des protéines liées de façon covalente. La séquence complète du plus petit plasmide identifié, pCLP, un élément de 25 kb isolé chez M. celatum, a identifié 19 régions codantes putatives dont 12 ont révélé une expression. pCLP présente des loci similaires à M. tuberculosis, suggérant la possibilité de transfert génétique entre M. celatum et M. tuberculosis. De plus des gènes similaires à ceux de plasmides circulaires ont été identifiés, gènes impliqués dans les mécanismes de partition et de post-ségrégation. L'analyse fonctionnelle suggère que ces gènes pourraient contribuer à la maintenance du plasmide linéaire pCLP.

Biodiversité des mycobactéries (Véronique Vincent)

Dans le cadre de collaborations internationales, une nouvelle espèce M. immunogenum a été décrite à partir d'isolements de l'environnement et d'isolements cliniques impliqués dans des infections nosocomiales et de nouvelles méthodes de typage ont été développées pour M. marinum et M. ulcerans. En collaboration avec des équipes finlandaises, des souches de la nouvelle espèce M. bohemicum ont été caractérisées en clinique humaine, vétérinaire et dans l'environnement.

Réponses immunitaires au cours de la tuberculose

Une réponse immunitaire protectrice contre une infection expérimentale par M. tuberculosis ne peut être obtenue que par l'injection d'un vaccin vivant. La souche de virulence atténuée de M. bovis, BCG, est ainsi utilisée comme vaccin contre la tuberculose. Deux thèmes majeurs de recherche ont été explorés au cours des dernières années. L'efficacité de l'administration par la voie digestive a été analysée de façon à proposer une voie d'administration du vaccin susceptible de diminuer les effets secondaires locaux et d'éviter les risques d'infections dues à l'injection comme la transmission de virus (VIH-SIDA, hépatite). La caractérisation des molécules immunodominantes, reconnues par le système immunitaire lors d'une vaccination, a été un thème majeur de recherche.

La vaccination par le BCG induit des réponses immunitaires protectrices par voie orale ou rectale (Micheline Lagranderie, Mohammad Abolhassani, Pierre Chavarot, Gilles Marchal)

L'administration du BCG par voie orale a été utilisée initialement par Calmette en 1921. Cette voie a été abandonnée du fait d'effets secondaires tels que le développement d'adénopathies cervicales importantes. La translocation, passage du BCG dans l'aire oropharyngée, n'est pas indispensable pour induire une immunité protectrice vis-à-vis d'une épreuve infectieuse par M. tuberculosis. La voie rectale a aussi été explorée. Cette méthode de vaccination serait facile à mettre en œuvre, peu dispendieuse et sûre. Les essais conduits chez trois espèces animales (souris, cobayes et macaques) montrent que les réponses immunitaires spécifiques sont similaires à celles observées après injection par voie sous-cutanée ou intradermique. Des niveaux de protection identiques ont été obtenus vis-à-vis d'une épreuve infectieuse avec une souche virulente au moins 6 mois après l'immunisation d'adultes ou de souriceaux nouveau-nés.

La présence de résidus mannose sur la molécule Apa est indispensable pour l'expression de l'antigénicité de cette molécule (Félix Romain, Pascale Pescher, Gilles Marchal)

Les molécules sécrétées de 45/47 kDa (Apa), présentes dans les filtrats de culture de BCG, M. tuberculosis ou M. bovis, ont été identifiées et purifiées sur leur capacité à interagir essentiellement avec les lymphocytes T ou les anticorps induits par l'immunisation avec des bactéries vivantes. Ces molécules sont glycosylées. Une élimination des résidus de mannose par voie chimique ou enzymatique a été effectuée. Ces molécules déglycosylées sont 30 à 100 fois moins actives que les molécules natives pour initier les réactions d'hypersensibilité de type retardé chez les cobayes immunisés par le BCG vivant ou pour stimuler in vitro les lymphocytes T spécifiques.

Les molécules Apa recombinantes produites dans M. smegmatis sont 4 à 10 fois moins efficaces que les molécules natives, en relation avec le type de glycosylation. Les molécules recombinantes produites dans E. coli sont quasiment inactives, en relation avec l'absence de glycosylation. Le rôle des résidus de mannose dans la constitution même de l'épitope reconnu par les lymphocytes T spécifiques est actuellement en cours d'étude, en particulier grâce à la synthèse de glycopeptides identiques aux peptides natifs.

Rôle de la superoxyde dismutase à zinc ou cuivre de M. tuberculosis (Olivier Dussurget, Pascale Pescher, Gilles Marchal)

Les superoxyde dismutases jouent un rôle déterminant dans la protection contre les dérivés actifs de l'oxygène. Les enzymes ont été rapportés comme étant des facteurs de pathogénicité chez de nombreuses espèces bactériennes. Ont été préparées des souches mutantes de M. tuberculosis et de BCG où le gène codant la superoxyde dismutase Zn/Cu est inactivé. De telles souches de bactéries montrent in vitro une susceptibilité légèrement accrue aux dérivés de l'oxygène. Par contre ces souches gardent la même virulence lors des infections expérimentales. La superoxyde dismutase Zn/Cu ne paraît pas jouer de rôle essentiel pour la pathogénicité de ces bactéries.

Utilisation des molécules 45/47 kDa (Apa) pour le diagnostic de tuberculose active (Cynthia Horn, Gilles Marchal)

Exploration de l'immunité cellulaire : Des molécules 45/47 kDa (Apa) natives ont été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes du sang provenant de malades atteints de tuberculose ou de sujets témoins sensibilisés, réactifs à la tuberculine. Alors que les lymphocytes de ces deux groupes de personnes sont stimulés de façon identiques par une PPD (tuberculine), seuls les lymphocytes des malades sont stimulés par les molécules 45/47 kDa (Apa).

Mise en évidence d'antigènes :Afin de développer une méthode de diagnostic rapide de la tuberculose, des anticorps monoclonaux dirigés contre les molécules de 45/47 kDa (Apa) et les molécules elles-mêmes ont été utilisés par Vohangy Rosolofo et Suzanne Chanteau à l'Institut Pasteur de Madagascar. Les premiers résultats montrent qu'il est possible de mettre évidence des antigènes spécifiques de M. tuberculosis dans des produits biologiques très pauvres en bacilles (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural..) souvent négatifs en culture.



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