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  Responsable : DELEPIERRE Muriel (murield@pasteur.fr)


  resume

 

Notre activité est centrée sur l'étude des relations structure :fonction des molécules biologiques et des problèmes de reconnaissance moléculaire ADN-protéine, protéine-protéine, oligosaccharide-protéine. Ces thèmes sont développés en étroite collaboration avec les équipes de l'Institut Pasteur.



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Étude structurale et fonctionnelle des protéines bactériennes impliquées dans l'acquisition de l‘hème (Clarisse Deniau, Nadia Izadi-Pruneyre, Nicolas Wolff, Anne Lecroisey)

Le fer, impliqué dans de nombreux processus biologiques, est indispensable pour les êtres vivants. Bien que très abondant, il est quasiment insoluble dans les milieux biologiques. Les bactéries ont donc développé différentes voies d'acquisition du fer qui peuvent coexister chez une même espèce. L'existence et l'utilisation de ces différentes voies dépendent de la bio disponibilité du fer dans l'organisme hôte. Ainsi des pathogènes opportunistes (Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa et Pseudomonas fluorescens) et l'agent responsable de la peste (Yersinia pestis) secrètent en condition de carence en fer des protéines, appelées hémophores (HasA pour Heme Acquisition system), qui leur permettent d'accéder à la plus grande source potentielle de fer chez l'homme, l'hème de l'hémoglobine. Les hémophores HasA, une fois dans le milieu extra cellulaire, captent l'hème sous sa forme libre ou liée à l'hémoglobine et le délivrent ensuite à un récepteur membranaire spécifique. Très homologues entre elles, les hémophores HasA forment une nouvelle famille de protéines sans homologie avec d'autres protéines connues.

Afin de comprendre leur mécanisme d'action, nous avons étudié le premier membre découvert de cette famille, HasASM (19 kDa) sécrété par S. marcescens. La structure tridimensionnelle de HasASm a été déterminée, par diffraction aux rayons X pour la forme hémo- et par RMN hétéro nucléaire multidimensionnelle pour la forme apo-. Elle montre l'implication de trois résidus dans la fixation de l'hème : une histidine et une tyrosine liées directement au fer de l'hème et une autre histidine via la tyrosine. Afin d'élucider l'importance et le rôle et de chacun de ces résidus dans l'activité de la protéine nous avons mesuré les pKa et l'état de protonation des histidines en absence et en présence du ligand et étudié les propriétés physico-chimiques et moléculaires des mutants dans lesquels ces résidus avaient été remplacés par d'autres résidus. Ces études ont été complétées par la mesure des paramètres thermodynamiques de la liaison hème-protéine. Les modifications induites par les mutations dans l'environnement et l'état du fer de l'hème ont été analysées par la spectroscopie RPE. L'ensemble de ces travaux nous a permis d'émettre des hypothèses sur les mécanismes de capture et de délivrance de l'hème de cette nouvelle famille de protéines. (Collaborations : Unité des membranes bactériennes, Institut Pasteur ; AFMB & BIP, CNRS Marseille ; Faculté de Pharmacie, Marseille. Department of Microbiology & Immunology, Emory, University, Atlanta, USA).

Etude structurale et dynamique du domaine C-terminal de la tyrosyl-tRNA synthétase de Bacillus Stéarothermophilus (Inaki Guijarro, Ada Prochnicka-Chalufour, Muriel Delepierre).

Les aminoacyl-tARN synthétases sont les enzymes qui traduisent le code génétique in vivo en attachant les acides aminés aux ARNs de transfert (tARN) apparentés. Elles constituent des cibles potentielles pour de nouveaux antibiotiques. Malgré des succès spectaculaires, des lacunes persistent dans leur connaissance structurale. A titre d'exemple, le domaine C-terminal (320-419) de la tyrosyl-tARN synthétase de bacillus stéarothermophilus impliqué dans la reconnaissance de l'anticodon du tARN-Tyr, est désordonné dans les cristaux, et sa structure reste inconnue. Ce domaine est indispensable pour l'interaction et le chargement du tARNTyr. La structure et la dynamique de ce domaine ont été étudiées en solution par RMN en collaboration avec le groupe d'Ingéniérie des protéines.

Le domaine C-terminal de la TyrRS est de type a/b et ne ressemble à aucun autre domaine de reconnaissance de l'anticodon connu pour le moment mais possède des homologies structurales avec la protéine ribosomale S4 ainsi que la protéine de choc thermique Hsp15. La topologie commune à ces molécules implique deux hélices a posées sur un feuillet b . Les six résidus identifiés par mutagénèse dirigée comme étant essentiels pour l'association à l'ARN de transfert se trouvent à la surface de la molécule et exposés au solvant. Cette structure est la première décrite pour un domaine de liaison du bras anticodon d'une tyrosyl-tARN synthétase et complète la structure de l'enzyme de B. stearothermophilus. Enfin, une étude dynamique montre que le domaine C-terminal se comporte comme une protéine globulaire et que l'extrémité N-terminale est beaucoup plus mobile que l'extrémité C-terminale. Le désordre observé dans la structure serait donc dû à la présence d'un lien flexible entre les domaines N-terminal et C-terminal de la protéine.

Structure de l'ADN et interaction ADN-protéine(Karine Wecker, Muriel Delepierre)

NF-kB est impliqué dans la régulation transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes dont ceux du HIV. Les structures en solution de fragments d'ADN de 16 paires de bases correspondant au site -kB du HIV (16N) et de séquences mutées (16M1 et 16M2) ont été déterminées par RMN du proton et du phosphore. Les séquences mutées correspondent soit à une mutation dans le site -kB (16M1) soit à une mutation dans les séquences flanquantes (16M2). Les données RMN ont permis de mettre en évidence pour le duplex natif (16N), un équilibre BI-BII (deux conformations différentes de la chaîne phosphodiester) au niveau des sites entourant les dix paires de bases du site kB. Une modélisation moléculaire des conformations extrêmes atteintes par le duplex natif (16N) a montré que celui-ci présente une conformation particulière lorsque les phosphates des séquences flanquantes du site -kB sont en conformation BII. En effet, toutes les paires de bases sont déplacées dans le grand sillon de l'ADN et l'hélice est courbée de 40° du côté du grand sillon comme dans les complexes cristallographiques ADN/NF-kB. Les séquences mutées que ce soit le duplex 16M1 mais surtout le duplex 16M2 pour lequel il n'y plus de phosphore en conformation BII ne présentent pas ces caractéristiques structurales et nous avons montré que l'association à NF-kB était moins efficace (16M2) voire abolie (16M1) dans ces conditions (collaboration E. Meurs). Ainsi, l'ensemble de ces résultats montre, pour la première fois, des différences importantes entre un ADN natif et un ADN muté dans la structure, la dynamique, et l'accessibilité des atomes du grand sillon où la protéine vient s'ancrer. Une nouvelle courbure dynamique et intrinsèque, liée à un effet de séquence a été mise en évidence sur le duplex natif qui pourrait jouer un rôle important dans la reconnaissance ADN:Protéine.

Etude structurale de déterminants antigéniques reconnus par un anticorps monoclonal protecteur dans le cadre du développement d'un vaccin contre la shigellose(Marie-Jeanne Clément, Catherine Simenel, Muriel Delepierre)

Ce projet entre dans le cadre de l'étude des polysaccharides bactériens en relation avec le développement de vaccins synthétiques chimiquement définis. Shigella flexneri est une bactérie à Gram négatif responsable de la forme endémique de la shigellose, une infection recto-colique aigüe dont les principales victimes sont les enfants de moins de cinq ans dans les pays en voie de développement. L'augmentation du nombre de souches de Shigella résistantes aux antibiotiques, rend la vaccination l'unique moyen d'éradication de la maladie. Le développement d'un vaccin contre la shigellose fait partie des priorités de l'O.M.S. dans le cadre du développement de vaccins entériques. La protection contre une infection par Shigella repose essentiellement sur la réponse humorale locale dirigée contre la partie polyosidique du lypopolysaccharide appelée antigène-O (Ag-O).

De plus, les anticorps conférant cette protection sont specifiques du sérotype de la souche de Shigella défini par la structure de l'Ag-O. Une stratégie possible pour la vaccination humaine consiste donc à développer des vaccins synthétiques chimiquement définis avec des molécules simples capables de mimer l'Ag-O et d'induire la synthèse d'anticorps protecteurs. Deux approches ont été développées qui consistent à utiliser soit des oligosaccharides synthétiques représentatifs des épitopes osidiques reconnus par des anticorps protecteurs soit des séquences peptidiques mimant les épitopes protecteurs. Le développement de chacune de ces deux options requiert une étude structurale de l'interaction des oligosaccharides et des peptides avec des anticorps protecteurs afin d'appréhender les bases moléculaires impliquées dans la reconnaissance antigène-anticorps permettant ainsi de définir la structure optimale mimant l'Ag-O. Les structures en solution des oligosaccharides synthétiques et des séquences peptidiques immunogéniques ont été étudiées par RMN soit sous formes libres soient sous formes liées à des anticorps protecteurs à l'aide des expériences de mesure de l'effet Overhauser nucléaire transferé et les épitopes caractérisés par des expériences de transfert de saturation (collaboration avec les Unités de Pathogénie Microbienne Moléculaire et de Chimie Organique).

Légendes des photos :

Photo 1: Structure cristallographique de la proteine HasA de Serratia marcescens sous sa forme Holo.

Photo 2: Structure RMN du doamine C-terminal de la tyrosyl-tARN synthétase



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LOZANO Liliane llozano@pasteur.fr
Tel : 01 40 61 37 02
Fax : 01 45 68 89 29

DELEPIERRE Muriel, CNRS murield@pasteur.fr

GUIJARRO Inaki, IP guijarro@pasteur.fr

IZADI-PRUNEYRE Nadia, CNRS nizadi@pasteur.fr

LECROISEY Anne, IP alecrois@pasteur.fr

WOLFF Nicolas, IP wolff@pasteur.fr

CLEMENT Marie-Jeanne, thèse mjeanne@pasteur.fr

DENIAU Clarisse, thèse cdeniau@pasteur.fr

STOVEN Véronique, CR1 CNRS, vstoven@pasteur.fr

WECKER Karine, post-doc wecker@pasteur.fr

PROCHNICKA-CHALUFOUR Ada, IP ada@pasteur.fr

SIMENEL Catherine, IP simenel@pasteur.fr


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