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  Responsable : COLE Stewart (stcole@pasteur.fr)


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Résumé: Afin de poursuivre notre avancée dans la connaissance de la tuberculose et de la lèpre, une approche de génomique comparative et fonctionnelle a été entreprise sur leurs agents étiologiques respectifs, Mycobacterium tuberculosis et M. leprae. De nouvelles cibles pour la mise au point de médicaments et de nouveaux candidats vaccins sous-unitaires ont été identifiés et sont actuellement en cours de caractérisation.

Cette approche a été étendue à un pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli, M. ulcerans.

Le pouvoir pathogène de Clostridium difficile et de C. perfringens est causé par de puissantes toxines, et on a découvert qu'un nouveau facteur sigma est nécessaire à la transcription des gènes des toxines majeures de C. difficile.



  rapport

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Génomique fonctionnelle des mycobactéries (Stewart Cole, Roland Brosch, Nadine Honoré)

A l'aide de biopuces, la présence au sein du complexe du bacille tuberculeux d'un certain nombre de régions chromosomiques variables, dont quelques-unes ont vraisemblablement contribué à l'atténuation des souches vaccinales, M. bovis BCG et Mycobacterium microti, a été mise en évidence. Leur rapport avec le pouvoir pathogène et les différences phénotypiques fait actuellement l'objet d'une analyse de génomique fonctionnelle. L'isoniazide est un puissant agent antituberculeux, dont la toxicité résulte de sa transformation en radicaux acyles lors d'une réaction enzymatique catalysée par la catalase-peroxydase. Le pouvoir pathogène de certains isolats cliniques isoniazido-résistants a été évalué à l'aide d'un modèle animal. Ce travail a révélé que la mutation rencontrée la plus fréquemment en clinique, katGSer315Thr, n'entraîne aucune modification significative de la virulence bactérienne. L'éthionamide (ETA), un agent anti-mycobactérien de seconde intention, est un analogue structural de l'isoniazide, qui après activation, interfère avec la synthèse de la paroi des bacilles. L'étude des mécanismes de résistance à l'ETA chez Mycobacterium leprae nous a permis dès à présent de mettre en évidence dans une souche de M. leprae résistante à l'ETA, des mutations dans le gène ethA dont le produit transforme l'ETA en agent toxique par S-oxydation.

Analyse génomique de Mycobacterium ulcerans (Timothy Stinear)

Mycobacterium ulcerans, pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli responsable de lésions de la peau chroniques et nécrosantes, s'est rapidement révélé être une cause importante de morbidité à travers le monde. Sa prévalence en Afrique de l'Ouest semble avoir considérablement augmenté depuis les années 1980. L'ulcère de Buruli est considéré comme la troisième maladie mycobactérienne la plus répandue chez les sujets immunocompétents, après la tuberculose et la lèpre. Contrairement aux autres pathogènes mycobactériens, M. ulcerans semble demeurer extracellulaire pendant la durée de l'infection et produit une toxine macrolide, la mycolactone. On a actuellement recours à l'approche génomique afin de comprendre l'épidémiologie, la biologie et la pathogenèse de cette importante maladie émergente, et de trouver de nouveaux moyens prophylactiques et thérapeutiques.

L'avancement du projet est conforme à nos prévisions. A ce jour, une banque de chromosomes bactériens artificiels (BAC) a été réalisée et le séquençage des extrémités de 300 clones achevé. Cette banque constitue l'échafaudage nécessaire à l'assemblage du génome à partir des plus petits fragments d'ADN contenus dans la banque de fragments aléatoires. Elle renferme environ 28.000 clones et a permis l'obtention de 47.000 lectures, représentant une couverture d'environ 6 à 7 fois du génome. L'assemblage et le comblement des lacunes progressent notablement, et les phases d'annotation et d'analyse du projet commenceront sous peu. Parallèlement nous avons criblé la banque des BACs pour identifier le gène codant pour la synthase polykétide de type I responsable de la production de mycolactone et isolé ainsi deux candidats potentiels.

Le séquençage du génome de Mycobacterium bovis (Thierry Garnier, Karin Eiglmeier)

Notre stratégie pour séquencer le génome de M. bovis (AF2122/97 spoligotype 9) comprenait deux axes. Dans un premier temps, des séquences ont été obtenues à partir des clones de différentes banques d'ADN génomique aléatoires et assemblées en contigs. En parallèle, une banque de BAC de M. bovis a été construite et les extrémités des inserts ont été séquencées. Par comparaison avec le génome de M. tuberculosis H37Rv, en exploitant le degré important d'identité de la séquence génomique de ces espèces (> 99.9%), les clones ont été positionnés et une carte représentant la quasi-totalité du génome a été établie. La sélection d'un jeu minimal de clones a permis d'orienter les différents contigs et d'obtenir la séquence génomique complète.

Étude du pouvoir pathogène et de la résistance aux antibiotiques des Clostridies

(Gilles Reysset, Bruno Dupuy)

Les recherches que nous menons sur le pouvoir pathogène de Clostridies toxinogènes (Clostridium perfringens et Clostridium difficile), concernent la mise en évidence des mécanismes de régulation des principales exotoxines connues, et l'identification et la caractérisation de nouveaux facteurs de virulence pouvant être impliqués dans la pathogénie de ces deux bactéries.

L'adaptation aux stress oxydatifs de C. perfringens, agent responsable de maladies pouvant aller de la simple intoxication alimentaire à l'entérite nécrotique ou la gangrène gazeuse, constitue vraisemblablement un facteur de pathogénicité important pour cette bactérie ubiquitaire, lui permettant en particulier de survivre dans les phagosomes des macrophages et d'éviter ainsi les défenses immunitaires de l'hôte. Certains gènes intervenant dans cette réponse ont été identifiés grâce à l'étude de mutants obtenus après mutagenèse par le transposon Tn916. C'est ainsi que nous avons montré que les gènes homologues aux gènes ydaD et ycdF de Bacillus subtilis, sont indispensables à la réponse à un stress superoxyde et hydroxyle, aussi bien en phase exponentielle de croissance qu'en phase stationnaire. Ils seraient impliqués dans la génération d'NADPH nécessaire au maintien de la balance d'oxydoréduction lors de l'arrêt de la croissance bactérienne. Parmi les autres gènes indispensables pour la survie de C. perfringens aux stress oxydatifs figurent : un gène codant pour une protéine fer—soufre (prismane protéine); le gène de la ß-glucuronidase (dont le produit semble jouer un rôle important dans la détoxication des molécules oxydées), ainsi qu'un gène codant pour une RNA hélicase, ATP dépendante.

Parmi les cibles potentielles qui permettraient l'élaboration d'inhibiteurs puissants capables de contrôler l'initiation et/ou l'établissement de ces organismes lors des infections, nous travaillons sur l'organisation fonctionnelle de quatre protéines appartenant à la famille réduite des protéines affines aux résidus cholines. Ces protéines CBP (Choline Binding Protein) sont présentes quelque soit le toxinotype des souches de C. perfringens et se trouvent majoritairement dans la membrane cellulaire. Leur rôle dans la pathogénèse et le pouvoir antigénique de chacune des protéines CBP est en cours d'étude.

Le pouvoir pathogène de C. difficile, responsable de colites pseudomembraneuses et de la majorité des diarrhées post-antibiothérapiques, repose essentiellement sur la capacité à produire en quantités suffisantes deux toxines majeures, ToxA et ToxB. La transcription des gènes tox est sous le contrôle du produit du gène txeR, qui intervient sur l'expression des toxines A et B en réponse aux changements de l'environnement. Nous avons montré que TxeR, comme son homologue UviA qui contrôle l'expression de la bactériocine de la souche CPN50 de C. perfringens, appartient à une nouvelle famille de facteurs sigma alternatifs (classe V).

Enfin, les résultats obtenus sur l'étude de la résistance au métronidazole de C. difficile, en collaboration avec une équipe de l'Hôpital Saint-Antoine, suggèrent que nous avons affaire à un mécanisme d'inactivation de l'antibiotique différent de celui mis en évidence chez Bacteroides fragilis. Nous avons montré que les souches cliniques isolées dans différents hôpitaux français, n'ont pas une origine clonale. Elles peuvent être différenciées à la fois par leur spectre de résistance (MLS, quinolones), leur contenu plasmidique, ou encore par le polymorphisme des produits de PCR obtenus à partir d'amorces non spécifiques ( RAPD).



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

FARGUES Anne-Marie (fargues@pasteur.fr)

COLE Stewart, IP (professeur, stcole@pasteur.fr)

GARNIER Thierry, IP, (chargé de recherche, tgarnier@pasteur.fr)

EIGLMEIER Karin , IP (chargé de recherche, kei@pasteur.fr)

BROSCH Roland, IP (chargé de recherche, rbrosch@pasteur.fr)

REYSSET Gilles, IP (chef de laboratoire, greysset@pasteur.fr)

DUPUY Bruno, IP (chargé de recherche, bdupuy@pasteur)

BRODIN Priscille, chercheur contractuel

PYM Alexander, postdoc. (a quitté l'unité le 15 novembre 2001)

STINEAR Timothy, postdoc.

MARMIESSE Magali (étudiante en thèse)

HONORE Nadine, ingénieur (nhonore@pasteur.fr)

SAINT-JOANIS Brigitte, ingénieur (bsjoanis@pasteur.fr)

BRIOLAT Valérie, technicienne (vbriolat@pasteur.fr)

GRONDIN Sophie, technicienne temporaire (sgrondin@pasteur.fr)


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