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  Responsable : BÂRZU Octavian (obarzu@pasteur.fr)


  resume

 

Notre activité de recherche est centrée en priorité sur les kinases ayant comme substrat les nucléotides ou les sucres et qui représentent des cibles potentielles en thérapie antibactérienne. Dans le projet de génomique structurale auquel notre laboratoire est associé, nous avons entrepris le clonage d'une dizaine de gènes de Mycobacterium tuberculosis codant des protéines de fonction inconnue, ou putative, dont certaines ont été surproduites chez E. coli.



  rapport

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1. Nucléoside monophosphate (NMP) kinases de M. tuberculosis

(H. Munier-Lehmann, en collaboration avec G. Labesse, D. Douguet, L. Dugué, S. Pochet, P. Herdewijn, S. Van Callenbergh, B. Gomes Guimaraes et P. Alzari)

Un des axes de nos recherches est l'obtention de nouveaux inhibiteurs spécifiques aux mycobactéries par conception rationnelle à partir de la structure tridimensionnelle résolue par cristallographie ou résonance magnétique nucléaire. Deux NMP kinases, ont été choisies pour leurs propriétés particulières par rapport à celles de leurs homologues eucaryotes, la TMP- et l'UMP kinase. Ce travail est l'objet d'un Programme Transversal de Recherche regroupant plusieurs équipes de l'Institut Pasteur. Cette année, environ quatre vingt analogues du substrat naturel (dTMP) ont été testés in vitro sur la TMP kinase de M. tuberculosis en tant qu'inhibiteurs. La moitié de ces composés a été synthétisée dans le groupe de S. Pochet (Unité de Chimie Organique). Cinq de ces molécules présentant une constante d'inhibition (Ki) de l'ordre du micromolaire seront prochainement testées sur des cultures de M. tuberculosis.

En ce qui concerne l'UMP kinase, aucune structure tridimensionnelle d'enzyme bactérien n'a encore été résolue à ce jour. L'UMP kinase de M. tuberculosis est un bon candidat du fait de sa stabilité et de sa solubilité en comparaison aux autres UMP kinases bactériennes (une dizaine) disponibles au laboratoire. Des cristaux obtenus l'année dernière en présence d'UTP uniquement, ont diffracté à une faible résolution (7-8 Å). Une nouvelle construction d'UMP kinase de M. tuberculosis portant une séquence étiquette plus courte a été réalisée. Des cristaux d'une meilleure qualité ont été obtenus avec cette nouvelle protéine, que ce soit en absence ou en présence de GTP. Des enregistrements auront lieu en fin d'année et nous espérons avoir une résolution inférieure à 2 Å pour obtenir la structure fine des sites de fixation des nucléotides et commencer la recherche d'inhibiteurs de l'UMP kinase de M. tuberculosis.

2. NMP kinases d'autres espèces bactériennes

(A.-M. Gilles, A. Ofiteru, C. Gagyi, H. Munier-Lehmann en collaboration avec T. Bertrand, P. Briozzo)

La substitution, par mutagenèse dirigée, des résidus impliqués dans l'interaction de la CMP kinase d'Escherichia coli avec la cytosine (Ser36, Asp132, Arg110 et Arg188) du substrat perturbe considérablement l'affinité et la vitesse de phosphorylation du NMP, tandis que les paramètres cinétiques vis-à-vis de l'ATP restent inchangés. Le variant Arg188Met, dont la stabilité est similaire à celle l'enzyme sauvage, a été cristallisé seul ou en complexe avec ses substrats naturels (CMP ou dCMP). La résolution de ces structures a mis en évidence l'élargissement de la poche dans laquelle se fixe le substrat, ce qui empêche les interactions de l'enzyme avec le sucre et le phosphate du substrat. L'approche structurale nous a aussi permis d'évaluer les conséquences induites par la substitution d'un résidu dans le maintien d'un réseau efficace de liaisons hydrogènes indispensable à la catalyse.

Nous avons poursuivi la caractérisation biochimique de plusieurs UMP kinases bactériennes, dont certaines proviennent d'organismes pathogènes. Ces recherches ont démontré l'hétérogénéité des préparations, due à la présence d'agrégats organisés ou non, et qui constitue un obstacle à l'obtention de cristaux fiables. Un variant de l'UMP kinase d'E. coli (Asp159Asn), plus soluble et homogène, est une alternative pour des études de cristallographie.

3. Autres cibles pour des agents antibactériens

(L. Assairi en collaboration avec G. Labesse et D. Douguet)

La NAD kinase phosphoryle le NAD pour former le NADP, cofacteur de nombreuses réactions cellulaires. Des variations quant à la spécificité du donneur de phosphate ont été observées entre les eucaryotes et les procaryotes. Les études de modélisation ont montré la relation entre les NAD kinases et la 6-phosphofructokinase d'E. coli. La présence d'un motif conservé chez les deux enzymes (GGDGT) nous a incité à remplacer par mutagénèse dirigée le résidu Asp ® Ala : la NAD kinase issue de N. meningitidis portant la substitution Asp ® Ala est inactive.

Nous avons choisi comme nouvelle cible la déphosphoCoA kinase. L'enzyme bactérien catalyse uniquement la dernière étape de la biosynthèse du coenzyme A. Chez les eucaryotes, un seul et même enzyme catalyse les deux dernières étapes de la biosynthèse du coenzyme A. Nous avons cloné le gène coaE codant la déphosphoCoA kinase de N. meningitidis (NMA2157) et de M. tuberculosis (Rv1631) et nous caractérisons actuellement les protéines recombinantes exprimées chez E. coli.

4. Opéron deoK de Salmonella typhimurium

(A.-M. Gilles, J. Ferdinand, C. Gagyi, L. Assairi en collaboration avec C. Le Bouguenec, T. Bertrand, P. Briozzo et J. Neuhard)

Les Salmonelles, contrairement à E. coli K12, sont capables d'utiliser le désoxyribose (dR) comme source unique de carbone et d'énergie. Nous avons montré que cette propriété était le fait de la présence de trois gènes codant respectivement une perméase (deoP), la désoxyribokinase (deoK) et une protéine de fonction inconnue (deoX). Ces gènes sont regroupés en opéron (deoK) dont l'expression est régulée par un répresseur (DeoQ). L'analyse par électrophorèse bidimensionnelle d'extraits de S. typhimurium, cultivée en présence ou en absence de dR, a mis en évidence, d'une part l'induction de la synthèse de ces protéines et d'autre part, l'induction de la synthèse des protéines codées par un autre opéron appelé deo. La recherche de l'opéron deoK dans les banques de données a montré qu'il était partiellement présent chez Agrobacterium tumefaciens et Rhodobacter spheroïdes, mais se trouvait dans son intégralité au sein de Citrobacter freundii et de certaines souches pathogènes d'E. coli, associé à des ilots de pathogénicité. Dans ce dernier cas, nous avons montré que l'opéron deoK garde toutes ses propriétés, à savoir, la capacité pour la bactérie d'utiliser le dR pour se multiplier. L'étude biochimique de DeoX montre que cette protéine est hexamérique et stable. Des cristaux diffractant à 2.7 Å ont été obtenus. Pour faciliter la résolution de sa structure tridimensionnelle, la protéine sélénométhionylée a été produite.

5. Génomique structurale à l'Institut Pasteur

(L. Assairi, H. Munier-Lehmann et D. Portnoï)

Dans le projet de génomique structurale auquel participe notre laboratoire, nous avons débuté le clonage de dix gènes de M. tuberculosis, codant des protéines de fonction inconnue et n'ayant aucune similitude avec des protéines autres que d'origine mycobacterienne ou d'actinomycète. En collaboration avec l'Unité de Biochimie Structurale, les protéines seront soumises à des essais de cristallogénèse pour obtenir leur structure tridimensionnelle. En parallèle, des études biochimiques seront entreprises pour déterminer leur fonction. Par ailleurs, ces protéines pourront à leur tour être des cibles potentielles en thérapie antituberculeuse.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LAMBRECHT, Marie-Régine, lambrech@pasteur.fr

BÂRZU, Octavian, CNRS, Directeur de Recherche 1, obarzu@pasteur.fr

GILLES, Anne-Marie, IP, Chef de Laboratoire.

MUNIER-LEHMANN, Hélène, INSERM, Chargée de Recherche 1.

PORTNOI, Denis, IP, Chargé de Recherche.

ASSAIRI, Liliane, CNRS, Chargée de Recherche 1.

GAGYI, Elena, Université de Médecine et de Pharmacie, Cluj-Napoca, Roumanie, Assistante de Recherche, (départ le 31/07/2001).

IONESCU, Mihaela, Université de Médecine et de Pharmacie, Cluj-Napoca, Roumanie, Assistante de Recherche.

OFITERU, Augustin, Institut Cantacuzène, Bucarest Roumanie, Doctorant.

SIRBU, Ioan Ovidiu, Université de Médecine et de Pharmacie, Timisoara, Roumanie, Chercheur, Docteur en Médecine.

FERDINAND, Joëlle, Stagiaire DEA, DEA soutenu en juillet 2001 (départ le 30/09/2001).

LAMBRECHT, Marie-Régine, Secrétaire, IP.


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