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  Responsable : MILON Geneviève (gmilon@pasteur.fr)


  resume

 

Dans notre Unité sont analysés et caractérisés, à l'échelle tissulaire, cellulaire et subcellulaire, des processus qui rendent compte des interactions durables que des parasites eucaryotes, les leishmanies, établissent avec (a) des organismes hôtes (la souris, un hôte expérimental, voire d'autres rongeurs adaptés à la captivité et l'homme) et/ou (b) des leucocytes hôtes (phagocytes professionnels). Ces analyses sont menées dans le contexte de la compréhension des processus asymptomatiques, des processus pathogènes et de leur prévention et dans celui, trop négligé, de la transmission des leishmanies de l'hôte mammifère à l'hôte vecteur, un diptère hématophage/telmophage, le phlébotome.



  rapport

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L'intitulé de notre Unité indique le cadre dans lequel s'inscrivent nos activités de recherche et de partage de savoir et de savoir-faire. En effet, les leishmanies, objets de nos études, sont des parasites protozoaires, qui dépendent de deux autres organismes vivants, un diptère hématophage et un mammifère. En l'absence d'un insectarium où produire les diptères hématophages, des phlébotomes, nous analysons et caractérisons, pour le moment, les interactions dynamiques et durables que ces parasites établissent chez des mammifères — souris de laboratoire, rongeurs en captivité, voire des sujets humains.

Les leucocytes phagocytaires mononucléés : des cellules hôtes qu'envahissent les promastigotes métacycliques de Leishmania spp. et au sein desquelles ils se différencient en amastigotes : quels processus discrets sont analysables, qualitativement et quantitativement, in vitro ? (N. Courret : 1/10/01 ® 31/12/01, E. Fontan, T. Lang, E. Prina, S. Abdi : depuis le 5/11/01, J.-C. Antoine).

Deux espèces de Leishmania, L. amazonensis et L. major (NIH 173), ont été sélectionnées dans la mesure où l'obtention, in vitro, du stade de développement, promastigotes métacycliques, est relativement aisée. Permettez-nous de préciser que, seuls ces promastigotes métacycliques s'établissent chez l'hôte mammifère, après qu'ils aient été délivrés p ar les phlébotomes femelles dans le derme. Caractériser les vacuoles parasitophores où (1) se " logent " les stades métacycliques, (2) se différencient et (3) se multiplient les stades amastigotes exige que soient produites, in vitro, des populations homogènes de leucocytes phagocytaires, qu'il s'agisse de leucocytes du lignage phagocytaire mononucléé ou des leucocytes " immatures " des lignages des leucocytes dendritiques, des lignages " versatiles " et réactifs à de nombreux signaux exogènes du système multifocal qu'est le système immunitaire ou du micro-environnement tissulaire dans lequel ils résident (par exemple le tissu cutané, les organes lymphoïdes secondaires). Nous sommes très attentifs à ce que ces " contraintes " expérimentales soient remplies pour tenter de mimer — le plus pertinemment possible — les micro-environnements tissulaires où s'établissent ces parasites intracellulaires. Jusqu'à présent, essentiellement des populations de leucocytes phagocytaires de souris ont été analysées. Il est aisé d'appréhender pourquoi, pour ces études, il est plus délicat de disposer de leucocytes humains. Il a été possible d'établir que les vacuoles parasitophores où s'établissent, se différencient, puis se multiplient L. amazonensis sont des compartiments subcellulaires très dynamiques dont la membrane et le contenu révèlent de nouveaux processus subcellulaires et moléculaires qui impliquent, entre autres, le cytosquelette actine et des compartiments aussi différents que les endosomes, les lysosomes. En outre, comme nous savons que ces leucocytes hôtes peuvent être des leucocytes qui activent des lymphocytes T naïfs ou qui ré-activent des lymphocytes T différenciés, sont également en cours d'étude les processus subcellulaires et moléculaires qui pourraient rendre compte de la biogénèse ou non des ligands des récepteurs des lymphocytes T CD4, CD8, voire des lymphocytes T CD1-restreints.

 

Le tissu cutané : un micro-environnement où s'établissent les leishmanies et où elles sont transmises au vecteur : de la pathogénèse des lésions cutanées plus ou moins transitoires au site d'inoculation, aux processus qui sous-tendent, dans des sites cutanés distants, leur transmission au vecteur (collaboration avec P. Volf et coll., Prague) (N. Courret : 1/10/01 ® 1/12/01, S. Lakhal : 1/10/01 ® 31/12/01, T. Lang, M. Lebastard, G. Marignac : depuis le 3/12/01, L. Nicolas, H. Saklani, G. Milon).

Pour tenter de caractériser les processus " discrets " via lesquels les leishmanies s'établissent, in vivo, dans le derme de leurs hôtes mammifères, nous avons tenu compte de propriétés de l'écosystème naturel au sein duquel circulent les leishmanies. En effet, chez leurs hôtes diptères, après qu'elles aient été ingérées sous forme d'amastigotes intracellulaires, les leishmanies sont libérées de cette niche intracellulaire et se différencient en promastigotes mobiles, extracellulaires. Après une phase d'expansion au contact des cellules épithéliales de l'intestin moyen (un stade de différenciation identifié par le terme de promastigotes procycliques), il y arrêt des processus de division cellulaire et différenciation en promastigotes méta-cycliques qui soit persistent dans un gel au niveau de la lumière de l'intestin moyen, soit atteignent le proboscis. Quel que soit le site à partir duquel sont régurgités ces promastigotes métacycliques, le nombre déposé dans le derme superficiel est estimé entre 10 et 1.000/sondage/repas sanguin. Aussi, avons-nous inoculé entre 10 et 10.000 leishmanies métacycliques, soit de L. amazonensis, soit de L. major dans le derme de l'oreille de souris C57Bl/6, B10D2 ou BALB/c. Plusieurs processus sont analysés : outre l'absence, la présence de signes cliniques, leur guérison ou non au site d'inoculation sont estimées les charges parasitaires, d'une part dans le site d'inoculation, mais aussi dans l'organe lymphoïde drainant, dans les tissus qui contrôlent l'homéostasie du sang (foie, rate, moelle osseuse) et des tissus cutanés distants glabres (oreille contralatérale, queue). Il importe de noter que la lésion cutanée transitoire au site d'inoculation chez C57Bl/6, B10D2 traduit une séquence d'événements discrets que nous pouvons décrire qualitativement et quantitativement comme suit : au niveau de l'oreille inoculée (a) une phase de différenciation promastigote ® amastigote, (b) une phase d'expansion des amastigotes au sein de leucocytes phagocytaires mononucléés, puis (c) une réduction de la charge parasitaire. Cette phase de réduction de la charge parasitaire est couplée à un recrutement de leucocytes non T non B (monocytes, neutrophiles, éosinophiles, des leucocytes dendritiques) qui est initié par l'extravasation, dans le derme, de lymphocytes T CD4 et CD8. Il semble que le recrutement et le renouvellement de ces lymphocytes CD4 et CD8 traduisent un processus d'activation initié dans le ganglion lymphatique drainant dès que des leucocytes abritant des amastigotes vivants atteignent cet organe lymphoïde secondaire. Notons que dans les sites cutanés distants atteints par des leishmanies dont la population reste stable et faible, aucun signe clinique n'est perceptible. Ce processus d'établissement durable d'une population parasitaire — dont l'effectif est stable dans un site cutané cliniquement muet — est en cours d'analyse : nous avons en effet formulé l'hypothèse que ces amastigotes sont les stades de développement transmissibles au vecteur hématophage. En outre, nous allons établir si ces amastigotes sont en Go.

 

LACK, une protéine commune à de nombreuses espèces de leishmanies, une source de peptides affins pour de nombreux allèles du complexe majeur d'histocompatibilité de la souris de laboratoire et de sujets humains ? Quelle(s) propriété(s) pour les lymphocytes dont les récepteurs clonotypiques lient entre autres le peptide AA 158-173 de LACK? (J.-C. Antoine, N. Courret 1/10/01 ® 31/12/01, T. Lang, M. Lebastard, H. Saklani, G. Milon, ; P. Buffet, CRC, I.P., E. Bourreau, P. Launois, I.P. Guyane).

LACK, une protéine dont le gène a été élégamment isolé (le crible reposant sur la disponibilité d'une lignée de lymphocytes T de souris BALB/c synthétisant de l'interféron ¡ ) est une sonde moléculaire qui a retenu notre attention dans plusieurs contextes : (a) sonde parasitaire " modèle " pour détecter, voire estimer la fréquence de lymphocytes T de souris réactifs aux parasites, ce en fonction de leur caractère invasif ou pas, (b) molécule dont l'expression et la synthèse ont été analysées dans le contexte du génome de Listeria monocytogenes et (c) plus récemment, sonde parasitaire " modèle " pour détecter des lymphocytes T CD4 et CD8 humains. Dans ce dernier contexte, soulignons que deux cytokines, l'interféron ¡ et l'interleukine 10, sont des signatures de la réactivité de lymphocytes T à LACK. Ces études sont menées en collaboration avec nos collègues de l'Institut Pasteur de Cayenne et du Centre de Recherche Clinique.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BRULE Chantal, IP – cbrule@pasteur.fr

ANTOINE Jean-Claude, DR2 CNRS, jantoine@pasteur.fr

FONTAN Elisabeth, Chargée de recherche IP, efontan@pasteur.fr

LANG Thierry, Chargé de recherche IP, tlang@pasteur.fr

MILON Geneviève, Chef de laboratoire IP, gmilon@pasteur.fr

NICOLAS Luc, Chargé de recherche IP, lnicolas@pasteur.fr

PRINA Eric , Chargé de recherche IP, eprina@pasteur.fr

ABDI Sofiane, DEA – sabdi@pasteur.fr

COURRET Nathalie, post-doc – ncourret@pasteur.fr

LAKHAL Sami, thèse Doctorat (– slakhal@pasteur.fr

MARIGNAC Geneviève, DEA – marignac@pasteur.fr

LEBASTARD Maï, Ingénieur IP - lebastar@pasteur.fr

MAILLET Christine, Agent de laboratoire IP - cmaillet@pasteur.fr

MARANGHI Eddie, Technicien d’animalerie IP – edma@pasteur.fr

SAKLANI Hélène, Technicienne supérieure IP - hesak@pasteur.fr

SEBASTIEN Karim, Technicien d’animalerie IP - ksebas@pasteur.fr


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