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  Responsable : Rivière Yves (riviere@pasteur.fr)


  resume

 

Notre projet de recherche est essentiellement axé sur l'étude du rôle des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) dans la pathogénèse des infections virales de l'homme et en particulier de l'infection par virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) et par le virus de l'hépatite C (VHC). Plusieurs approches sont développées in vitro: cartographie des épitopes T et importance des réactivités croisées, présentation de particules virales exogènes aux CTL, contrôle de la réplication virale, et in vivo : reconstitution du système immunitaire dans des cohortes de patients infectés et traités par anti-rétroviraux, importance de l'induction de CTL dans l'efficacité des protocoles de vaccination dans des modèles animaux.



  rapport

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A . Cartographie des épitopes cytotoxiques, réactivités croisées entre sous-types viraux F.Buseyne, en collaboration avec C. Rouzioux et S. Blanche, Hôpital Necker. La diversité génétique du VIH-1 pose la question de son impact sur la reconnaissance de différents sous-types par les effecteurs CD8+. Cette question est particulièrement importante dans le domaine vaccinal. Les réactivités croisées des effecteurs cytotoxiques dirigées contre différents sous-types de VIH-1 ont été étudiée contre un épitope T bien défini et non plus au niveau de la protéine prise dans sa globalité. Des lignées reconnaissant l'épitope gag QASQEVKNW présenté par deux molécules HLA-B différentes ont été caractérisées chez cinq patients. Chaque patient reconnaît de 2 à 9 des 10 variants testés. Tous reconnaissent une combinaison de variants différents ce qui apporte la démonstration de la variabilité individuelle des reconnaissances croisées de variants viraux d'un même épitopeT cytotoxique (Buseyne et Coll , J. Virol., 2001).

B . Présentation de particules virales du VIH exogènes aux lymphocytes CD8+, F. Buseyne, T. Paquet, en collaboration avec O. Schwartz (Institut Pasteur) et J.P Abastado (IDM, Paris). Les cellules dendritiques et les macrophages présentent les particules du VIH aux lymphocytes T CD8+ en absence de réplication virale. L'entrée de l'antigène est dépendante de l'interaction entre l'enveloppe du virus et son récepteur. Elle est plus efficace que l'ingestion des protéines par phagocytose ou macropinocytose et permettrait de cibler des antigènes vaccinaux (Buseyne et Coll., Nature Medicine 2001).

C . Inhibition de la réplication virale par les lymphocytes CD8+. M. Février. Nous avons poursuivi ce travail afin de déterminer si la fonction de contrôle de la réplication de VIH, sans cytolyse, était exercée spécifiquement par un des sous-types de cellules CD8+: Tc0, Tc1 ou Tc2. Des clones T CD4+ et CD8+ ont été établis à partir de cellules du sang périphérique de sujets séronégatifs et séropositifs pour VIH. La classification en type cellulaire a été faite sur la détection de la production des cytokines prototypes (IFN et IL4) par marquage intracytoplasmique. Des cellules T CD4+ [de type Th0, Th1 et Th2] ont été infectées avec un virus R5 (YU2b) ou un virus X4 (LAI) et mises en coculture avec les différents sous-types de cellules T CD8+. Il ressort de cette étude que YU2b est beaucoup moins bien contrôlé que LAI quel que soit le type de cellules CD4+ infectées (si on regarde la fréquence des clones qui contrôlent); tous les sous-types de cellules T CD8+ sont capables de contrôler LAI quel que soit le type des cellules infectées (Th0, Th1 ou Th2).

D. Suivi des fonctions immunitaires chez l'enfant infecté par le VIH et traités par multithérapie antirétrovirale. F. Buseyne, B. Corre, F. Porrot, N. Bellal,.en coll. avec D.Scott-Algara (Institut Pasteur) et C.Rouzioux et S. Blanche, Hôpital Necker.

Depuis plusieurs années nos efforts sont focalisés sur l'étude d'une cohorte d'enfants infectés par le VIH par voie materno-fœtale .Une partie importante des enfants participent à des protocoles de thérapie anti-rétrovirale combinée avec ou sans anti-protéase. L'efficacité des traitements est évaluée par la mesure de la charge virale (plasmatique, virémie cellulaire et provirus intégré). Pour l'évaluation de l'impact du traitement sur la reconstitution du système immunitaire, les différentes populations lymphocytaires CD4+ et CD8+ (marqueurs d'activation et naif/mémoire) sont étudiées en cytométrie de flux. L'activité fonctionnelle cytotoxique (LTC) est étudiée par la technique conventionnelle de relargage au chrome et par les techniques alternatives (Elispot et tetramères) nouvellement développées. Nous avons utilisé des tétramères de la molécule HLA-A2 complexés avec deux peptides immunodominants de la p17 et de la RT (collaboration Immunotech). La grande majorité des PBMC des enfants testés fixent le tétramère Gag (26/28) et le tétramère Pol (21/28). Les lymphocytes fixant les tétramères ont un phénotype de cellule "mémoire/activée" [CD27+/-, CD28-, CD45RA-, CD45RO+, HLADR+, CD69-]. Le suivi longitudinal d'un enfant montre une diminution du nombre des CD8+ Tetramères Gag+ parallèle à la diminution de la charge virale pendant les premiers mois de suivi. Cependant l'échec thérapeutique révélé par une remontée de la charge virale est aussi caractérisé par une remontée des cellules CD8+ Tétramères Gag + (Scott-Algara et Coll., J. Inf. Dis., 2001). Ce travail souligne l'intérêt de cette technologie pour la révélation des spécificités des lymphocytes CD8+, et nous poursuivons cette approche par la mesure de la capacité fonctionnelle de sécrétion de cytokines et chimiokines par les lymphocytes CD8+ s'attachant aux tétramères.

E. Modèles animaux: immunisation à base d'ADNs codant pour des domaines antigéniques des virus SIV et VIH-1 fusionnés à l'antigène de surface du virus de l'hépatite B . Etude d'immunogénicité et pouvoir protecteur chez le macaque. [collaboration avec A.L Puaux et M.L. Michel (INSERM U163, Institut Pasteur), R.Legrand (CEA, Fontenay) et Anne Marie Aubertin, (Strasbourg)]

Comme approche vaccinale pour lutter contre l'infection par le VIH-1 deux stratégies sont combinées : d'une part, pour favoriser la réponse humorale et cellulaire, un système de présentation d'épitopes utilisant comme molécule porteuse l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (AgHBs); d'autre part, pour stimuler la réponse cytotoxique, une vaccination à base d'ADN utilisant des vecteurs codant pour des domaines antigéniques de SIV et de VIH-1 fusionnés à cet antigène. Le macaque est le modèle animal utilisé dans cette étude puisqu'il présente l'avantage de pouvoir être éprouvé par infection avec un virus chimérique SHIV portant l'enveloppe de VIH-1. L'immunogénicité de nouveaux vecteurs ADN codant pour des domaines antigéniques de l'enveloppe de VIH-1, de la capside et de la protéine nef de SIV est en cours. Une épreuve virulente est prévue avec un virus chimère SHIV portant l'enveloppe d'un isolat bitropique.

F- Étude de l'existence d'une réponse lymphocytaire CD8 chez des sujets co-infectés par VIH-1 et VHC. G. Janvier et F. Porrot (Coll avec H. Fontaine, S. Pol et H.Zylberberg, service d'Hépatologie, Hôpital Necker). Environ dix pour cent des sujets infectés par le VIH-1 sont co-infectés par le VHC. Le but du travail était d'évaluer l'importance des activités CD8+ spécifiques du VIH-1 et du VHC chez des sujets co-infectés par ces deux virus. En utilisant des techniques de relargage au chrome et Elispot associées à l'utilisation de peptides synthétiques et de vecteurs vaccines exprimant les séquences peptiques virales nous avons montré que les réponses dirigées contre le VHC étaient beaucoup moins fréquemment détectées que celles dirigées contre le VIH-1.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

JEWIARZ Danielle (djewiarz@pasteur.fr)

BUSEYNE Florence, IP (florence@pasteur.fr)

FEVRIER Michèle, CNRS (mfevrier@pasteur.fr)

RIVIERE Yves , IP (riviere@pasteur.fr)

BELLAL Nassima médecin stagiaire

FAVRE David , stagiaire Université Nantes (dfavre@pasteur.fr)

IGLESIAS Maria Candela, DEA (candela@pasteur.fr)

PAQUET Thierry thésard (tpaquet@pasteur.fr)

CORRE Béatrice, technicienne (bgs@pasteur.fr)

JANVIER Geneviève, technicienne (gjanvier@pasteur.fr)

PORROT Françoise, technicienne (fporrot@pasteur.fr)


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