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  Immol


  Responsable : ACUTO, Oreste (oacuto@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité d'Immunologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires de l'activation des lymphocytes T. Les signaux adressés au lymphocyte T (LT) par la cellule présentatrice d'antigène (CPA) sont relayés à l'intérieur de la cellule par un appareil formé de récepteurs membranaires et une multitude de protéines intracellulaires (enzymes, adaptateurs, et composants du cytosquelette). Ce système décode les signaux et ainsi faisant contribue à déterminer la prolifération, la différentiation ou l' état de tolérance ou encore la mort du lymphocyte T.



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Régulation de la protéine tyrosine kinase ZAP-70

(Vincenzo Di Bartolo, en collaboration avec B. et M. Malissen)

Zap-70 (Zeta chain-associated protein de 70 kDaltons) est une protéine tyrosine kinase (PTK) centrale dans le déclenchement de l'activation du LT. Elle s'associe au récepteur de l'antigène (TCR) quand celui-ci est engagé stablement avec ses ligands (les complexes antigène/CMH). Zap-70 possède une région de connexion (dite interdomaine B) entre ses deux domaines SH2 et son domaine tyrosine kinase. Dans cette région résident des tyrosines régulatrices qui sont phosphorylées lorsque Zap-70 se lie au TCR. Nous avons auparavant étudié le rôle des tyrosines 315 (Y315) et 319 (Y319) de l'interdomaine B in vitro et montré que cette dernière exerce une fonction unique, étant nécessaire pour l'activation de Zap-70 par la PTK Lck. En collaboration avec le groupe de Bernard et Marie Malissen à Marseille, nous avons étudié le rôle physiologique de ces sites de régulation dans des souris " knock-in " portant l'une ou l'autre tyrosine mutée. Par cette étude nous avons conclu que la Y315 joue un rôle mineur dans le développement et l'activation des LT. En revanche, la Y319 provoque un défaut grave de sélection positive thymique et confirme in vivo son importance dans la régulation de la fonction de Zap-70. Dans une étude parallèle, nous avons identifié le défaut fonctionnel associé à la mutation de la Y315. En effet, par un mécanisme allostérique ce résidu assure une association efficace de Zap-70 aux motifs ITAM des chaînes CD3-zeta du TCR.

Un nouveau modèle de souris transgénique pour l'étude de la régulation des LT CD8 naïfs (Maria Elena Marquez-Campos, Vincenzo Di Bartolo)

L'obtention d'un mutant gain-de-fonction de ZAP-70, dont l'activité est fortement augmentée seulement après engagement du TCR, nous a conduit à la création d'une nouvelle souris transgénique afin de tester l'effet d'une baisse du seuil d'activation sur la survie et l'état de tolérance des LT CD8. Cette souris exprime le mutant de ZAP-70 (appelé " SuperZap ") seulement dans les LT CD8 matures, et ce, grâce à l'utilisation d'une séquence " enhancer " derivée du gène CD8. L'analyse de cette souris ne montre pas de changements dans le nombre de LT CD8, ni de signes apparents d'activation ou d'autoimmunité. En revanche, des modifications drastiques du profil de cytokines produites par les LT CD8 naïfs sont observées. Ces résultats suggèrent une différentiation adaptative des LT CD8 hyper-réactifs vis-à-vis du soi.

Rôle de la PTK Itk dans l'activation du LT révélé par des études d'imagerie calcique et microscopie électronique

(Frédérique Michel, en collaboration avec A. Trautmann)

Trois familles de PTK régulent les premiers événements d'activation du LT, les PTK de type Src (Lck et Fyn), Zap-70/Syk et celles de la famille Tec (Tec, Itk et Rlk).  En collaboration avec l'équipe de Alain Trautmann (Hopital Cochin, Paris) nous avons étudié l'impact des PTK Lck, Fyn, Zap-70 et Itk dans la formation de la zone de contact entre le LT et la CPA et l'augmentation du calcium intracellulaire. Ces études ont été menées par imagerie calcique et microscopie électronique. La formation et la stabilisation de cette zone (appelée synapse immunologique ou SMAC) sont sous le contrôle du cytosquelette d'actine. Nos études révèlent que les PTK Lck, Fyn et Zap-70 jouent un rôle primordial dans la formation de la synapse immunologique, tandis que Itk ne semble pas être impliqué. Ces PTK n'influencent pas la formation des premiers contacts entre le lymphocyte T et la CPA mais Itk joue un rôle essentiel dans l'augmentation du calcium intracellulaire lors de l'activation médiée par le TCR.

Contribution de CD28 au signal d'activation du LT.

(Frédérique Michel, Giorgio Mangino, Setsuko Mise-Omata)

Le mécanisme moléculaire à travers lequel CD28 exerce sa fonction de co-stimulateur de l'activation des LT n'est pas clair. Afin d'élucider cet aspect, une étude biochimique de la signalisation a été conduite dans notre Unité en utilisant des systèmes expérimentaux reproduisant des conditions physiologiques d'activation. Nous avons ainsi établi qu'un certain nombre de protéines intracellulaires, dont Vav-1, l'activateur des petites protéines G Rac-1 et CDC42 et la PTK Itk sont activées lors de l'engagement de CD28 avec son ligand naturel B7 présent sur les CPA. Nos résultats ont aussi montré de manière surprenante que, en l'absence de co-stimulation, l'engagement du TCR à lui seul ne produit pas une augmentation efficace de la phosphorylation sur tyrosine de substrats intracellulaires, y compris CD3-zeta et ZAP-70. Cela résulte en une diminution considérable des réponses biologiques. Des études visant à comprendre l'action de CD28, et en particulier de ses effecteurs intracellulaires, ont révélé que CD28 facilite l'activation via deux mécanismes interconnectés. Le premier, en favorisant le contact intime des membranes entre le lymphocyte T et la CPA (fonction d'adhésion), et de cette façon facilite l'engagement du TCR ; le second, en favorisant l'activation de la Phospholipase C gamma-1 et donc contribuant à l'augmentation du calcium intracellulaire, mais aussi d'autres voies de signalisation. En effet, nos études révèlent pour la première fois que CD28 est une source essentielle de la PTK Itk nécessaire pour l'activation de la Phospholipase C gamma-1. Nos résultats suggèrent donc que CD28 rend plus efficace la signalisation du TCR en fournissant à celui-ci un complément quantitatif et qualitatif d'effecteurs (voir figure). Ainsi faisant CD28 baisse le seuil d'activation du LT dans des conditions (physiologiques) de concentrations limites de complexes antigène/CMH.

Légende:

Organisation moléculaire du signal d'activation du LT : Le schéma indique les protéines effectrices qui composent les voies de signalisation activées par l ‘engagement, respectivement, du TCR (bleu) et CD28 (orange). Nos travaux récents indiquent une contribution quantitative et qualitative de CD28 au signal d'activation du LT initié via le TCR. GEMs : glycosphingolipid-enriched membranes. LAT (Linker for Activation of T cells) est une protéine adaptatrice qui fonctionne comme " organisateur " central de l'appareil de signalisation des lymphocytes T.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

HOUSSIN, Wendy, whoussin@pasteur.fr

ACUTO, Oreste, IP (Chef de l’Unité, oacuto@pasteur.fr)

MICHEL, Frédérique, IP (Chargée de recherche, fmichel@pasteur.fr)

DI BARTOLO, Vincenzo, IP (Assistant de recherche, vbartolo@pasteur.fr)

MANGINO, Giorgio, chercheur post-doctoral

MISE, Setsuko, chercheur post-doctoral

BLANCHET, Fabien, étudiant en thèse

IRLES, Claudine, étudiante en thèse

MARQUEZ CAMPOS, Maria Elena, étudiante en thèse

ATTAL-BONNEFOY, Géraldine, technicienne, gattal@pasteur.fr

DUFOUR, Evelyne, technicienne, edufour@pasteur

SECHET Emmanuel, technicien, esechet@pasteur.fr


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