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  Responsable : Pierre-André CAZENAVE (cazenave@pasteur.fr)


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Les activités de recherche de l'Unité concernent l'immunophysiopathologie d'infections parasitaires: maladie de Chagas et paludisme en parallèle avec des études plus fondamentales portant sur les répertoires immuns.



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Etude de la plasticité du Système Immunitaire. (A. Six, P.A. Cazenave)

Nous étudions la plasticité du système immunitaire et plus particulièrement du compartiment B (lymphocytes B et Ig) dans des situations extrêmes où le répertoire germinal des régions VH et VL est très réduit. Dans ce but, nous avons dérivé une souris congénique de C57BL/6 (T15i.K-.l SEG). Elle est invalidée pour l'expression des chaînes légères K et possède le locus l SEG de la souris SEG (M.spretus) qui se caractérise par une délétion de l'unité de recombinaison l 1 l 3 et n'exprime donc que 2 Vl (Vl 2 et Vl x) ; elle est transgénique (" knock-in ") pour le VHT15 (ce gène code pour la chaîne lourde réarrangée du myélome TEPC15 présentant une activité anti-phosphorylcholine). Nous avons d'abord caractérisé le locus l SEG et étudié le répertoire des immunoglobulines et des lymphocytes B (avant et après immunisation contre des antigènes modèles) de la souris B6.k -.l EG, intermédiaire de la souris " ultra-monoclonale " B6.T15i. k -.l SEG. Cette étude a été menée avec une grande variété de techniques : RIA, ELISA, SDS-PAGE, FACS, PCR ancrée et Immunoscope. Ayant récemment obtenu la souris B6.T15i. k -. l SEG, la même étude est en cours pour cette dernière.

Le modèle de la souris B6.T15i. k -. l SEG offre un outil remarquable pour analyser l'évolution du répertoire des lymphocytes B, non seulement au niveau systémique mais aussi dans les différents compartiments lymphocytaires. En effet, une image par cytométrie de flux permet de distinguer (et par conséquence d'isoler) quatre sous-populations B caractérisées par les domaines variables qu'elles expriment à leur surface : VHT15+, l x+ ; VHT15+, l 2+ ; VHT15-, l x+ ; VHT15-, l 2+. L'utilisation appropriée d'anticorps permet de trier les lymphocytes B de ces sous-populations selon leur appartenance aux groupes B1-a, B1-b ou B2, et ceci dans différents compartiments lymphocytaires. On peut ainsi non seulement analyser le répertoire de ces différents compartiments lymphocytaires mais encore étudier leur devenir dans différentes situations à la suite de leur transfert chez des souris immunodéficientes.

Tolérance des cellules T CD8+ aux chaines légères kappa (Lk ) des immunoglobulines maternelles. (D. Rueff-Juy)

L'analyse du répertoire et de la fonction des cellules T de souris déficientes en chaines (Lk ) (k -/-) nées de mères hétérozygotes (k +/-) nous a permis (1) de montrer que la tolérance des cellules T spécifiques de Ck , est de forte intensité jusqu'à l'âge de 5 semaines, puis diminue avec la décroissance d'Ig maternelles dans le sang des descendants (2) et de suggérer que des cellules régulatrices de type CD4 étaient impliquées dans la tolérance des cellules CD8+ spécifiques de Ck , dans la mesure où la tolérance était rompue quelques jours après l'injection d'anticorps anti-CD4.

L'antigène reconnu par les cellules régulatrices est dans la plupart des cas inconnu et ceci particulièrement dans les modèles physiologiques (non-transgéniques). Afin de caractériser l'antigène impliqué dans notre modèle expérimental nous avons introduit la mutation k chez des souris déficientes en molécules de classe II du MHC (k -/- Ab -/-) ou en molécules CD1(k -/- CD1-/-). Chez les souris (k -/- Ab -/-) la population CD4+ est fortement diminuée. Il a été démontré que la population CD4+ restante est sélectionnée sur la molécule CD1 et qu'elle consiste principalement en cellules NKT. L'étude conjointe de la réponse CD8 anti-Ck chez ces 2 types de souris ainsi que le traitement par des anticorps témoins ou des anticorps anti-CD4 vient de nous montrer que les cellules CD4 impliquées ne sont pas restreintes par la molécules CD1 mais par la molécule I-A. Nous envisageons actuellement de caractériser la molécule reconnue par les CD4 régulatrices.

Immunopathologie du processus infectieux à Trypanosoma cruzi. (Paola Minoprio)

Nous avons précédemment proposé que les mitogènes et les superantigènes, composants essentiels des microorganismes peuvent être responsables de réponses lymphocytaires polyclonales et non spécifiques et ainsi, expliqueraient la stratégie utilisée par des pathogènes pour circonscrire les défenses immunitaires de l'hôte et assurer leur survie. Nous avons montré que les formes métacycliques infectieuses de Trypanosoma cruzi sécrètent des molécules responsables d'un tel mécanisme d'évasion immune. En utilisant différentes techniques nous avons décrit une protéine parasitaire (TcPA45) impliquée dans l'activation polyclonale des lymphocytes B et dont l'activité mitogénique est indépendante des cellules T. Nous avons décelés deux gènes codant TcPA45 par génome, localisées sur deux chromosomes différents et observé une transcription différentielle de ces gènes dans des stades différents du développement du parasite. L'immunolocalisation de la protéine TcPA45 confirme que les formes infectieuses et non-infectieuses du parasite expriment différentiellement TcPA45 intracellulaire et sécrétée. Nous avons décrit que TcPA45 est aussi la première proline racémase eucaryote observée. Les isoformes de TcPA45 ont des Vmax et Kmax similaires et des exigences de pH compatibles avec une activité enzymatique à la fois dans les compartiments internes et externes de la cellule. Il est important de signaler que l'activité mitogènique est abolie ou fortement inhibée par les inhibiteurs du site catalytique. Par ailleurs, les parasites portant des constructions anti-sens du gène TcPA45 ne sont pas viables ou difficilement, ce qui suggère que la protéine racémase doit être essentielle pour le métabolisme du parasite. Inversement, les parasites qui surexpriment la TcPA45 envahissent plus efficacement les cellules de l'hôte suggérant un rôle de la protéine racémase dans la virulence du parasite . Les résultats ont des implications importantes pour la biologie du parasite et sa pathogénicité, aussi bien que sur le rôle possible des acides aminés D dans le phénomène immun. Etant donné le rôle immunoregulateur important joué par les anticorps naturels, des déviations possibles dans le répertoire préexistant d'anticorps chez les hôtes résistants ou sensibles pourraient être essentielles pour faciliter ou neutraliser l'activation polyclonale induite par le parasite. Nos résultats suggèrent ainsi que le contrôle des activités de la racémase mitogènique pourrait être une cible importante pour une intervention immune.(Site web du laboratoire)

Etude du répertoire TCRb lors du neuropaludisme chez la souris (A. Six, S.Pied, P.A. Cazenave)

Dans les modèles murins de neuropaludisme, les lymphocytes T sont nécessaires à la survenue de la neuropathologie. Nous avions mis en évidence chez les souris B10.D2 infectées par P.berghei ANKA et développant un neuropaludisme (CM+) une expansion de lymphocytes T Vb 8+. Nous avons alors entrepris d'étudier le répertoire des lymphocytes Ta b du sang et de la rate de la même lignée de souris après infection par P. berghei afin de déterminer la nature de l'expansion de lymphocytes T Vb 8+ et d'étudier l'évolution de l'ensemble du répertoire chez les souris CM+ par comparaison aux souris infectées ne présentant pas de neuropaludisme (CM-).

La technique Immunoscope a été utilisée pour obtenir une image qualitative du répertoire TCRb par la description des profils de tailles de CDR3 pour chaque segment génique Vb . Un nombre important d'échantillons ayant été analysé, nous avons écrit un ensemble de logiciels (ISEApeaks®, Institut Pasteur) pour permettre l'analyse informatique des données. Le premier programme assure automatiquement l'extraction, le lissage, le tri et le formatage dans Excel des données issues du logiciel Immunoscope. Un second programme permet d'assembler les données issues de différents échantillons et d'analyser ces données. Différentes méthodes d'analyses de la perturbation de répertoires immunitaires ont été implémentées et utilisées ainsi qu'une nouvelle méthode spécifiquement dédiée à la recherche d'expansions oligoclonales récurrentes.

Nous avons pu ainsi déterminer que l'expansion de cellules Vb 8+ est de nature polyclonale, excluant la possibilité d'une stimulation antigénique classique. D'autre part, cette approche nous a permis de choisir les Vb les plus perturbés et présentant le plus d'expansions oligoclonales récurrentes pour une analyse plus en détail par l'étude de la répartition des tailles de CDR3 des combinaisons Vb -Jb . De même, les combinaisons les plus perturbées et présentant les expansions oligoclonales les plus récurrentes ont été choisies pour le séquençage direct des réarrangements afin de déterminer leur clonalité. Des réarrangements récurrents ont été trouvés dont l'association avec le neuropaludisme est en cours d'analyse.

Déterminisme génétique de la résistance au paludisme après infection de la souris par Plasmodium berghei ANKA. (S. Pied, P.A. Cazenave)

La majorité des lignées de souris de laboratoire infectées par la souche létale P. berghei ANKA développent un neuropaludisme (CM) fatal, à l'exception de la souris DBA/2 qui est résistante (CM-). Nous avons montré qu'elle était protégée du CM par l'intégration dans son génome d'une séquence provirale (mtv7) qui inclue une région ORF codant un superantigène. Les souris résistantes au CM meurent plus tardivement d'anémie hémolytique due à l'hyperparasitémie (HP+).

Le survol d'une série de 12 lignées consanguines nouvelles, dérivées de couples capturés dans la nature en des régions eurasiennes très diverses, nous a permis d'en détecter 6 qui présentent un phénotype CM- de forte résistance au CM. Comme on l'escomptait, ces souris CM- meurent des conséquences de l'hyperparasitémie (HP+).

Pour évaluer les bases génétiques de la résistance au CM, nous avons croisé l'une de ces souris CM- (souris W) avec la souris C57BL/6 qui est particulièrement sensible (CM+). Les individus F1 ont le phénotype CM- de la lignée parentale W. Pour cribler les locus qui contribueraient à la résistance, nous avons analysé une cohorte de souris résultant de croisements en retour avec l'autre lignée parentale C57BL/6. Une analyse du génome de cette cohorte nous a permis de démontrer une association significative du phénotype CM- à deux régions génétiques disctinctes : l'une sur le chromosome 1 (c 2= 18,99, p<1,3x10-5), l'autre sur le chromosome 11 (c 2= 16,51, p<4,8x10-5). Dans une deuxième série d'expériences, nous avons analysé les souris de la génération F2. Nous avons observé chez 17% des individus, un phénotype inattendu, jusqu'alors inconnu dans l'infection par P.berghei. Il s'agit de souris CM- qui présentent aussi un phénotype HP- de résistance à l'hyperparasitémie qu'elles contrôlent parfaitement et survivent. Nous avons montré que ce phénotype HP- est lié à deux régions génétiques : l'une sur le chromosome 9 (c 2= 14,53, p=0,001), l'autre sur le chromosome 11 (c 2= 14,78, p<0,001).



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AMRANI Yacine, Doctorant.

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COLLETTE Alexis, Doctorant.

GREGOIRE Christophe, Post-Doctorant.

SOULARD Valérie, Doctorante.

BARBIER Eliane, IR IP (ebarbier@pasteur.fr)

BERNEMAN Armand, IR IP (berneman@pasteur.fr)

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COSSON Alain, TQL, IP (acosson@pasteur.fr)

COTNOAN Nicolas, TDVPI, IP (coatnoan@pasteur.fr)

DRAPIER Anne-Marie, IE CNRS, (amdrapie@pasteur.fr)

GORGETTE Olivier, TS2D IP, (ogorgett@pasteur.fr)

VOEGTLE Danièle IE CNRS, (dvoegtle@pasteur.fr)


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