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  Responsable : DIGHIERO Guillaume (dighiero@pasteur.fr)


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IMMUNOPATHOLOGIE DES CELLULES B ET T HUMAINES

Le travail de l'Unité d'Immuno-hématologie et Immunopathologie a été consacré à l'étude : I) Des Autoanticorps naturels (AAN) et l'autoimmunité; II) La leucémie lymphoïde chronique (LLC), et III) L'Immunopathologie du SIDA. Dans le domaine des autoanticorps naturels, le travail a porté sur la création d'un modèle transgénique de la maladie des agglutinines froides humaines. Dans la LLC nous nous efforçons de mieux définir le rôle de l'expression génique dans l'oncogénèse de la LLC, les mécanismes à l'origine de la sous-expression du récepteur B dans cette maladie et à l'étude " in vitro " de la faisabilité d'une vaccination anti-idiotypique a l'aide de cellules dendritiques dans la LLC. Dans le domaine du SIDA, nous nous sommes attachés à l'étude de la reconstitution immunologique chez des malades au stade de porteur asymptomatique traités par trithérapie antivirale.



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AUTOANTICORPS NATURELS ET AUTOIMMUNITE

Contributions du laboratoire dans le domaine.

En 1981 avec S. Avrameas, nous avons pu démontrer l'existence fréquente dans le sérum humain normal d'autoanticorps naturels polyréactifs. Par la suite, nous avons pu démontrer, que les précurseurs de ces AAN existaient avec une fréquence très importante dans le répertoire B normal (1983) et qu'ils étaient présents très tôt pendant l'ontogénie (1985). Cette notion a été définitivement établie par nous (1986) et d'autres groupes en démontrant que ces anticorps sont une composante très importante du répertoire germinal, puisqu'ils apparaissent tôt dans l'ontogénie, expriment des idiotopes récurrents et des gènes en configuration germinale.

Ces travaux montrent clairement que l'autoimmunisation est un phénomène physiologique. Si ces autoanticorps sont toujours dirigés contre des composants du soi, ce qui autorise à les appeler autoanticorps, ils ne sont toutefois pas spécifiques de l'individu, puisqu'ils reconnaissent des déterminants publics, présents chez tous les individus d'une même espèce, et parfois comme c'est le cas des autoanticorps anti-ADN et anti-récepteur de l'acéthylcholine, communs à des espèces différentes. Cette dernière caractéristique est par ailleurs partagée par les autoanticorps pathologiques.

Le deuxième élément nouveau fut la démonstration que ces autoanticorps naturels sont capables de reconnaître à la fois plusieurs antigènes aussi éloignés que le DNA, les protéines du cytosquelette et des antigènes phospholipidiques (1983 et 1988). Cette notion, qui a été très controversée lors de notre description initiale (1982 et 1983) est à présent établie. Le mécanisme par lequel ces anticorps sont capables de réagir simultanément avec des antigènes très différents reste cependant à définir.

Si le rôle physiologique de ces AAN reste à établir, il est très probable que ces AAN constituent une composante essentielle de l'immunité naturelle et qu'ils jouent un rôle majeur comme première barrière de défense. Reste à définir si ce répertoire, pourrait constituer un répertoire précurseur des anticorps immuns et des autoanticorps pathologiques.

 

1) Des Autoanticorps naturels (AAN) et l'autoimmunité, à travers l'étude de l'anémie hémolytique par agglutinines froides. (Christine Pourcel (responsable de projet), Séverine Havouis, Pablo Oppezzo et Gérard Dumas).

La maladie des agglutinines froides (AF) humaine, est caractérisée par la production d'autoanticorps froids dirigés contre des déterminants glycolipidiques du globule rouge, qui donnent lieu à une anémie hémolytique autoimmune (AHAI). Nous avons étudié au niveau moléculaire une agglutinine froide (CAGAS) qui avait la particularité d'agglutiner les globules rouges de souris et de les hémolyser en présence de complément, ce qui fait d'elle un candidat de choix pour créer un modèle expérimental murin. Après avoir produit une CAGAS recombinante nous avons réussi à démontrer qu'elle était capable lors de son injection à des souris d'induire la maladie. Ces résultats montrent que cette agglutinine froide est pathogène pour la souris et ouvre la possibilité de créer un modèle murin de la maladie des AF humaine.

Nous avons construit des souris double transgéniques (dTg) exprimant la chaîne lourde et légère de la CAGAS. Chez ces souris l'IgM humaine est détectée dans le sérum à des taux non négligeables (100 µg/ml), mais sa capacité d'agglutination (1/64) est insuffisante pour induire une anémie hémolytique. Nous avons montré que les cellules auto-réactives subissaient d'une part un processus de délétion clonale. D'autre part, la majorité des cellules B exprimant la chaîne µ humaine, l'associent à la chaîne légère k de souris, ce qui empêche la délétion de ces cellules B, qui en associant la chaîne lourde humaine à la chaîne légère de souris perdent leur capacité autoréactive (récepteur editing).

Chez l'Homme, les taux d'AF sont transitoirement augmentés lors d'une infection par Mycoplasma pneumoniae, ce qui peut éventuellement donner lieu à une AHAI. Pour contourner les mécanismes de tolérance, les souris transgéniques pour l'AF GAS ont été infectées avec M. pulmonis. La concentration d'AF GAS, et le titre d'agglutination sont fortement augmentés dans le sérum des souris dTg infectées. Nous avons donc supposé que la levée de tolérance, induite par l'infection, soit due à l'interaction de l'IgM GAS avec des oligosaccharides de surface du mycoplasme. Cette infection expérimentale mime l'augmentation des AF chez l'Homme, et fournit un modèle animal pour étudier le déclenchement de l'AHAI.

2) La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC).

La leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) est la forme la plus fréquente de leucémie dans les pays occidentaux. Elle est considérée comme une maladie correspondant à l'accumulation lente et progressive de lymphocytes B petits et matures ayant une origine clonale commune et dont la survie est prolongée par un défaut d'apoptose. Les cellules B de LLC présentent un phénotype caractéristique défini par l'expression de faibles taux de plusieurs récepteurs de surface comme les immunoglobulines (Ig) de membrane, la molécule CD79b et CD20 et l'expression constante de CD5 et CD23.

La LLC est une maladie tumorale avec une évolution relativement lente, puisque la médiane de survie dépasse 7 ans. Certains patients ont une espérance de vie qui n'est pas modifiée par l'existence de l'hémopathie, ne sont pas traités et meurent de pathologies non associées. D'autres vont mourir dans des délais variables de complications liées à la maladie. Il est donc fondamental de disposer dès le diagnostic de critères qui permettent d'évaluer le risque individuel de progression afin de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique dont les modalités découlent de l'évaluation pronostique.

Contributions du laboratoire dans le domaine.

1) Etudes pronostiques et thérapeutiques dans la LLC.

Avec Jacques-Louis Binet, nous avons décrit une classification pronostique de cette maladie qui a permis de séparer les malades en trois groupes pronostiques et qui a été adoptée comme la classification internationale de référence. Depuis 1976, avec Jacques-Louis Binet, Claude Chastang et Philippe Travade, nous avons constitué le Groupe Français Coopératif pour l'étude de la Leucémie Lymphoïde Chronique. Ce groupe comprend plus de 50 services français et a réussi à inclure plus de 3300 malades dans des protocoles thérapeutiques. L'étude de trois protocoles randomisés nous a permis de montrer que : 1) Les malades appartenant au groupe de bon pronostic ne devraient pas recevoir de traitement dans un premier abord, puisque ces malades ont une survie proche de celle d'une population normale du même sexe et du même âge. Fait important, ce groupe comprend deux tiers des malades atteints par cette maladie. 2) Dans les formes graves de la maladie, nous avons démontré l'intérêt d'une association polychimiothérapique (CHOP) et d'un analogue des purines, la Fludarabine.

2) Etudes biologiques.

a) Le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC exprime d'une façon caractéristique de faibles taux d'immunoglobulines de membrane.

Depuis 1972, nous nous intéressons à la biologie du lymphocyte B qui prolifère dans la LLC. Nous avons montré que le lymphocyte B de la LLC, exprime une quantité très faible d'immunoglobulines de membrane (1974, 1976, 1980). Cette anomalie, qui associée à des défauts fonctionnels de ce lymphocyte ont conduit à postuler que le lymphocyte B qui prolifère dans cette maladie est une cellule B " anergique ", est encore de nos jours considérée comme le meilleur marqueur diagnostic de cette maladie.

b) La pathologie maligne du lymphocyte B implique fréquemment le répertoire producteur des AAN.

Dans trois modèles différents (LLC, lymphomes folliculaires et protéines monoclonales) nous avons pu démontrer que le répertoire qui produit les AAN, est fréquemment la cible des processus de transformation maligne du lymphocyte B. Comme ce répertoire, du fait de son autoréactivité est constamment sollicité, nous avons postulé que cet état d'activation permanente, pourrait créer les conditions propices à la survenue d'un événement oncogénique.

c) Etude de l'expression des gènes VH dans la pathologie maligne du lymphocyte B.

Le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC correspond phénotypiquement à une cellule B naïve, qui ne devrait pas avoir subi un processus de mutation somatique. Toutefois, avec Harry Schroeder, nous avons démontré qu'environ la moitié des malades présente un nombre considérable de mutations somatiques. Ceci nous a conduit à faire l'hypothèse que la cellule maligne impliquée dans cette maladie pourrait correspondre soit à une cellule vraiment naïve (n'ayant pas passé par le centre germinatif) soit à une cellule mémoire ayant au préalable passé par le centre germinatif. Plus récemment, un groupe anglais et un groupe américain ont confirmé notre hypothèse en démontrant que les LLC dont les cellules ne présentent pas de mutations somatiques correspondent à des formes plus indifférenciées et par conséquent plus malignes de la maladie. Ces résultats conduisent à proposer que la LLC ne serait plus une maladie unique, mais deux maladies, selon le niveau mutationnel des gènes des Ig, que présentent les lymphocytes B malins.

Trois projets sont à présent réalisés dans notre Unité :

i) Etude de l'expression génique dans la LLC. (Coordinateur : G. Dighiero en représentation du Groupe Français pour l'étude de la LLC).

Dans le cadre du projet national CIT2 (Carte d'identité des tumeurs) nous avons présenté un projet d'étude de l'expression génique dans la LLC, en représentation du Groupe Français pour l'étude de la LLC, qui est un groupe coopératif auquel participent depuis plus de 25 ans plus de 40 centres en France. Il a été capable d'activer trois grandes études thérapeutiques à long terme dans la LLC (Protocoles LLC-80, 85 et 90), qui ont inclus plus de 3300 malades (>60 % du total des malades de la littérature inclus dans des essais randomisés).

ii) Etude des mécanismes liés à la sous-expression du récepteur B pour l'antigène dans la LLC (Béatrice Brogard (responsable), Ch. Magnac).

Dans la LLC, le récepteur B est caractérisé par la très faible expression des Ig de membrane (Igm) et de la chaîne Igb (CD79b). Le récepteur B pour l'antigène (BCR) est composé d'IgM complexée avec deux hétérodimères covalents Iga /Igb qui jouent un rôle essentiel dans l'expression du BCR et la transduction du signal d'activation. Pendant les dernières années, de nombreuses études ont été consacrées à l'étude des gènes codant pour les Ig et les chaînes Iga /Igb .

Pour mieux définir les mécanismes à l'origine de la sous-expression du BCR, nous avons examiné la transcription des gènes impliqués dans la constitution du récepteur, la synthèse protéique et le transport intracellulaire du récepteur. Nos résultats montrent que : 1) Il n'existe pas d'anomalies génétiques entravant l'expression du BCR. 2) Il n'existe pas d'altérations majeures au niveau de la transcription des différents gènes impliqués dans la constitution du BCR. 3) L'analyse de la synthèse protéique du BCR, montre une discordance importante entre l'expression intracytoplasmique, qui ne présente pas d'altérations majeures et la très faible expression membranaire de celui-ci. 4) L'absence de toute altération génétique au niveau de la portion intra-membranaire de l'IgM, qui pourrait compromettre l'insertion membranaire du récepteur, ainsi que l'absence de toute altération génétique au niveau de la protéine chaperonne la calnexine, qui joue un rôle majeur dans l'assemblage du BCR. 5) Un défaut de maturation, chez plusieurs malades, des chaînes m nouvellement synthétisées en une forme résistante à l'Endoglycosidase H empêche le transport du BCR à la surface. Ces résultats montrent qu'un défaut post-transcriptionnel au niveau du trafic intracellulaire joue un rôle important dans la sous-expression du BCR dans la LLC. Comme un défaut similaire a été observé dans des cellules B anergiques dans un modèle murin, ces résultats constituent un argument supplémentaire en faveur de l'idée que le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC constitue un lymphocyte B anergique. 6) Des études en microscopie confocale montrent un défaut dans l'assemblage des différentes molécules du récepteur. Ces résultats montrent qu'un défaut post-transcriptionnel au niveau de l'assemblage et du trafic intracellulaire joue un rôle important dans la sous-expression du BCR dans la LLC. Comme un défaut similaire a été observé dans des cellules B anergiques dans un modèle murin, ces résultats constituent un argument supplémentaire en faveur de l'idée que le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC constitue un lymphocyte B anergique.

iii) Etude " in vitro " de la faisabilité d'une vaccination anti-idiotypique à l'aide de cellules dendritiques dans la LLC (Responsable : Françoise Vuillier en collaboration avec Daniel Scott-Algara).

Dans la LLC, la chimiothérapie conventionnelle est en mesure d'induire fréquemment une régression importante de la masse tumorale. Toutefois, la rechute de la maladie est inéluctable et il est couramment admis que cette maladie demeure incurable. Ainsi, l'immunothérapie avec des anticorps monoclonaux ou des vaccins anti-idiotypiques pourrait occuper une place de choix dans le traitement de cette maladie.

Nous avons décidé d'évaluer " in vitro " la possibilité d'induire des cellules cytotoxiques anti-tumorales en stimulant des cellules dendritiques du malade avec l'idiotype tumoral, suivi dans un deuxième temps de l'incubation de ces cellules avec les cellules T du malade, dans le but d'induire une lignée T anti-tumorale.

Dans un premier temps, une étude de la fonctionnalité des cellules dendritiques dans la LLC a été entreprise. Ainsi, des monocytes frais dérivés de patients atteints de LLC et de sujets normaux ont été induits à se différencier en cellules dendritiques en les incubant avec le GM-CSF et l'IL-4. Ils ont ensuite été comparés pour leurs caractéristiques morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles. Nos résultats ont montré que : 1) Des cellules dendritiques fonctionnelles peuvent être générées à partir des monocytes circulants des patients atteints de LLC et que leur fonctionnalité et phénotype est proche de ceux observés dans les cellules dendritiques normales, 2) A la différence des cellules dendritiques dérivées des sujets normaux celles dérivées à partir de sujets atteints de LLC sécrètent spontanément une quantité importante d'IL-10 et 3) L'IFN-g associé au CD40L joue un rôle important dans l'induction de la sécrétion d'IL-12 et IL-15 par les cellules dendritiques de LLC.

Ces mêmes cellules dendritiques ont été ensuite incubées avec les cellules T du malade et dans des conditions de culture particulières nous avons réussi à induire dans la majorité des cas des lignées T à faible pouvoir cytotoxique anti-tumoral.

3) Immunopathologie de la maladie liée au VIH.

Contributions du laboratoire dans le domaine.

La perte sélective des lymphocytes CD4 est le fait marquant de l'infection par le VIH. Bien que la déplétion de la population CD4 soit le mécanisme principal par lequel le virus induit le syndrome d'immunodéficience, de nombreuses anomalies fonctionnelles ont été rapportées dans les cellules CD4, CD8, NK, cellules B et les monocytes/macrophages. Depuis 1988, nous nous sommes intéressés à l'étude des sous-populations CD4, CD8 et NK, pendant l'infection par le virus VIH. Ces études ont réussi à établir l'existence d'une anergie fonctionnelle des sous-populations cellulaires CD4, CD8 et NK déjà présente aux stades initiaux de la maladie, à un moment où les cellules CD4 n'accusent pas une diminution marquée (1992,1992,1996).

Nos travaux ont permis de montrer pour la première fois, que le défaut prolifératif observée dans les cellules CD4 est directement corrélé à un déficit dans le processus de phosphorylation des tyrosines, à une expression diminuée de la tyrosine-kinase p56lck et à une expression augmentée de la p59fyn. Cet aspect biochimique est très proche de celui retrouvé dans des clones murins anergiques, où l'on observe la triade déficit de phosphorylation, sous-expression de p56lck et surexpression de p59fyn (1994). Nous avons aussi pu prouver que le stress oxydatif chronique jouait un rôle majeur dans l'altération très profonde de la réponse proliférative observée dans les lymphocytes CD4 des sujets infectés par le VIH et qu'un traitement anti-oxydant était capable de rétablir une réponse proliférative très perturbée et la fonction phosphatase de la molécule CD45 (1996).

Pour évaluer le rôle potentiel des superantigènes, dans le défaut fonctionnel des effecteurs du système immun, nous avons étudié la réponse des lymphocytes circulants des sujets infectés par le VIH, à la nucléocapside rabique. Nous avons pu montrer que la stimulation préalable par ce superantigène induisait un processus d'anergie fonctionnelle des lymphocytes périphériques, consécutive à l'augmentation considérable dans la sécrétion d'IL-4 et IL-10 (commutation Th1-Th2).

Projet de recherche :

Influence des traitements anti-viraux dans la reconstitution immunologique des malades infectés par le VIH. (Responsable : Daniel Scott-Algara en collaboration avec Colette Jouanne et Miguel Alfonzo-Diaz).

Dans le domaine du SIDA, nous nous sommes attachés à l'étude de la reconstitution immunologique chez des malades au stade de porteur asymptomatique traités par trithérapie antivirale. Le Dr. Scott a assuré la responsabilité d'un essai randomisée patronnée par l'ANRS (protocole 072 TRILEGE) ayant pour but d'étudier la reconstitution immunologique après tri-thérapie anti-virale chez des malades infectés par le virus VIH. Un essai similaire étudiant la reconstitution immunologique chez les enfants infectés par le VIH, a été aussi entrepris en collaboration avec Y. Rivière.

Cette étude a montré clairement que les cellules CD4 et CD8 naïves augmentaient très précocement après l'institution de la trithérapie et que cette augmentation persistait dans le temps. Les cellules CD4 et CD8 naïves correspondaient à la moitié de l'augmentation de ces deux sous-populations lymphocytaires. Un résultat surprenant de cette étude a été l'absence de modification dans l'expression des marqueurs d'activation. En conclusion, une augmentation rapide et soutenue des cellules naïves a été observée ; ce qui serait en faveur d'un renouveau important des cellules du système immun et d'une absence d'affectation des cellules souches chez ces malades étudiés à un stade précoce de la maladie.

Nous évaluons en ce moment l'effet de la reconstitution immunologique dans la restauration de la fonction immune contre trois agents opportunistes (CMV, T. Gondii et P. Carinii ), chez des patients recevant une tri-thérapie antivirale. Pour étudier ce problème, des souris immunodéficientes Scid/beige sont reconstituées par les lymphocytes de patients mis sous tri-thérapie et par des lymphocytes de sujets normaux séropositifs et séronégatifs pour T. Gondii. Ces souris ainsi humanisées sont ensuite injectées avec T. Gondii et la réponse immune spécifique développée est étudiée. Nos résultats indiquent que la survie des souris injectées avec des lymphocytes obtenus après tri-thérapie est significativement plus longue que celle observée chez ces mêmes malades avant la tri-thérapie. Ces résultats indiquent que la thérapie anti-virale est capable de reconstituer la réponse spécifique contre T. Gondii.

Photo 1

Souris normale/Souris présentant un syndrome cryopathique : perte bilatérale des pavillons auriculaires

Figure 2 :

Marquage intracytoplasmique des PBL de souris dTg avant (J 0) et 38 jours après l'infection par M. pulmonis.



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BOUYSSIE Reine, bouyssie@pasteur.fr

BROGARD Béatrice, Chargée de Recherche CNRS, bbrogard@pasteur.fr

POURCEL Christine, Chef de Laboratoire IP, cpourcel@pasteur.fr

SCOTT-ALGARA Daniel, Chargé de Recherche IP, scott@pasteur.fr

ALFONZO DIAZ Miguel, malfon@pasteur.fr

HAVOUIS Séverine, shavouis@pasteur.fr

OPPEZZO Pablo, popezzzo@pasteur.fr

MALOUM Karim

BEDORA Marie, Technicienne Supérieure IP, mbedora@pasteur.fr

DUMAS Gérard, Technicien Supérieur IP, dumas@pasteur.fr

JOUANNE Colette, Ingénieur d'Etudes CNRS

MAGNAC Christian, Ingénieur IP, magnac@pasteur.fr

VUILLIER Françoise, Ingénieur IP, vuillier@pasteur.fr

Laboratoire de préparation :
LAURENT Nathalie


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