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  Responsable : LAFAYE Pierre (plafaye@pasteur.fr)


  resume

 

L'activité du Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps est orientée essentiellement sur l'analyse fonctionnelle et structurale des anticorps murins ou humains. Le Laboratoire s'intéresse plus particulièrement aux anticorps impliqués dans les maladies auto-immunes et aux anticorps capables de neutraliser des micro-organismes ou des toxines bactériennes ou eucaryotes.

Pour réaliser cette analyse nous utilisons et adaptons à notre objectif les techniques modernes de biologie cellulaire et de biologie moléculaire.

Ce volet est complété par une étude des antigènes, ligands ou inhibiteurs peptidiques présentés à la surface de phages (méthode du "phage display").

De plus, le Laboratoire établit des collaborations avec des Unités de l'Institut Pasteur ou d'autres organismes de Recherche dans le but d'appliquer la technologie des hybridomes à des projets de recherche fondamentale ou appliquée. Dans ce cadre, le Laboratoire a préparé et caractérisé des anticorps monoclonaux murins à spécificité fine.



  rapport

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Développement de nouvelles thérapies contre les infections respiratoires à l'aide d'anticorps administrés par voie topique (Pierre Lafaye)

Ce projet a obtenu un financement interne, sous forme d'un PTR, en collaboration avec Jean-Michel Alonso et Muhammed-Kheir Taha, unité des Neisseria, Hugues Bedouelle et Patrick England, unité de Biochimie Cellulaire et Sylvie Bay, unité de Chimie Organique.

Ce projet a pour but de développer une nouvelle approche thérapeutique pour combattre certaines infections bactériennes du tractus respiratoire. Cette approche est basée sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la phosphorylcholine (PC), qui est une structure caractéristique de nombreuses bactéries pathogènes. Notre étude porte sur 2 bactéries, Neisseria meningitidis et Streptococcus pneumoniae. Ultérieurement, si les résultats obtenus sont prometteurs, cette étude pourra être étendue à d'autres pathogènes exprimant la PC, comme Haemophilus influenzae. Les trois bactéries mentionnées, dont l'habitat naturel est le tractus respiratoire, sont responsables d'une part d'infections locales (angine, otites, pneumopathies...) et d'autre part d'infections systémiques telles que des septicémies et des méningites, par passage dans le sang et franchissement de la barrière hémato-encéphalique.

Pour cela, nous allons :

- purifier des antigènes bactériens contenant la PC, et en synthétiser des mimes chimiquement définis.

- produire des anticorps humains et murins ciblant la PC exprimée à la surface des bactéries.

- évaluer l'efficacité des anticorps dans des modèles précliniques in vitro et in vivo.

Anticorps monoclonaux dirigés contre des toxines bactériennes (Pierre Lafaye)

Des anticorps monoclonaux dirigés contre les toxines bactériennes peuvent être d'une grande utilité en diagnostic et en thérapeutique. C'est pourquoi nous avons développé une collaboration avec l'unité des Toxines et Pathogénie Microbienne pour obtenir des anticorps contre l'anthrax et la toxine botulique. La collaboration avec Michelle Mock et son équipe nous a permis d'obtenir des anticorps dirigés contre les 3 protéines (PA, LF et EF) responsables de la toxicité de Bacillus anthracis. Ces anticorps ont été caractérisés et des études préliminaires semblent montrer qu'ils sont capables de neutraliser les effets toxiques de Bacillus anthracis. La collaboration avec Michel-Robert Popoff et son groupe a débuté récemment. Des anticorps recombinants simple-chaîne (scFv) dirigés contre la toxine botulique ont été obtenus et sont en cours de caractérisation. 

Obtention d'anticorps humains par stimulation antigénique in vitro et librairie combinatoire (Farida Nato)

Pour produire des anticorps humains contre les antigènes non vaccinants, il est indispensable d'immuniser in vitro les lymphocytes avant leur immortalisation pour obtenir une librairie immune d'anticorps.

Les lymphocytes proviennent des amygdales, source intéressante de lymphocytes B car ils représentent 50 à 60% des cellules totales, présents à tous les stades de différenciation. Il est possible de générer une réponse primaire in vitro en utilisant les lymphocytes CD4+ sensibilisés in vivo par l'anatoxine tétanique du fait de la vaccination obligatoire contre le tetanos. L'immunogène utilisé est l'épitope T de l'anatoxine tétanique (ATT) couplé à l'épitope B de l'antigène d'intérêt. Cette approche permet d'obtenir la commutation isotypique in vitro car la réponse polyclonale est de type IgG (IgG2 ou IgG3). Il est possible de reproduire dans les grandes lignes la coopération cellulaire entre les différentes cellules immunocompétentes présentes dans le centre germinatif. La réponse ainsi obtenue reste cependant faible et peu de lymphocytes B spécifiques sont présents, ce qui peut expliquer l'absence d'hybridomes par immortalisation par fusion ou par transformation par le virus de Epstein Barr. Pour ces raisons, nous produisons les fragments d'anticorps par génie génétique et voulons fabriquer des librairies immunes spécifiques pour l'antigène d'intérêt.

Développement de tests rapides pour le diagnostic de la peste et du choléra (Farida Nato)

Ce projet a obtenu un financement interne jusqu'en juillet 2002 sous forme de Projet Transversal de Recherche (PTR) en collaboration avec Suzanne Chanteau chef d'Unité Peste/Tuberculose de l'Institut Pasteur de Madagascar, J. M. Fournier chef d'Unité du choléra et des vibrions, et E. Carniel chef d'Unité de Bactériologie Moléculaire et Médicale.

L'objectif est de disposer d'un test immunochromatographique simple et rapide pour le diagnostic de la peste et du choléra qui sont 2 maladies bactériennes graves, à déclaration obligatoire et soumises au règlement sanitaire international. Elles sont dues respectivement à Yersinia pestis et Vibrio cholerae. L'antigène F1, une glycoprotéine capsulaire spécifique de Y. pestis, excrété en abondance est parfaitement indiqué pour le diagnostic de la peste car il est présent en grande quantité dans le bubon, dans le sang et les urines des patients à de plus faibles concentrations. Dans le cas du choléra, le lipopolysaccharide est un bon candidat pour le diagnostic. Toutes les méthodes disponibles (PCR, ELISA, Dot-blot) sont difficiles à mettre en œuvre dans les pays en voie de développement. C'est pourquoi nous avons proposé de développer des tests rapides et simples à réaliser par des agents de santé. La bandelette doit être trempée dans un tube contenant l'échantillon à tester et la lecture se fait après 10 minutes. L'interprétation des résultats est aisée grâce à l'utilisation de particules d'or colorées. Les bandelettes peuvent être expédiées sous enveloppe et conservées quelques mois à température ambiante. La qualité intrinsèque du test de détection de l'antigène F1 est excellente (spécificité et sensibilité proches de 100%. Deux études ont été conduites à Madagascar. La première a concerné les districts et les centres de santé. La concordance entre les résultats des bandelettes réalisées au laboratoire central et dans ces centres périphériques est de 90% La deuxième étude a été réalisée au laboratoire central de la peste, sur des prélèvements suspects. La corrélation entre l'ELISA et la bandelette est de 90%. La bactériologie reste la méthode de référence, mais l'utilisation de la bandelette augmente de 59% le nombre de prélèvements positifs. Afin d'assurer une meilleure surveillance épidémiologique de la peste à Madagascar, l'immunochromatographie sera adoptée au Laboratoire Central comme test complémentaire à la bactériologie.

Concernant V. cholerae O139 et O1, un test spécifique et sensible pour la détection du LPS est obtenu et la validation sur le terrain (Bengladesh pour O139 et Madagascar pour O1) est en cours.

La Calréticuline est un récepteur potentiel, impliqué dans la pénétration cellulaire des anticorps anti-ADN (Nabila Seddiki-Si Ahmed)

Une protéine de 50kDa a été purifiée comme un récepteur potentiel à partir d'extraits membranaires de cellules lymphocytaires et d'anticorps anti-ADN, F14-6 ou H9-3 (provenant d'une fusion de souris lupique F1 (New Zealand Black x New Zealand White) biotinylés puis fixés sur une colonne d'immunoaffinité. Cette protéine a été identifiée par micro-séquençage comme étant la calréticuline. La microscopie confocale et les analyses de cytomètrie en flux montrent que la calréticuline est présente à la surface de nombreux types cellulaires. Elle est reconnue par différents anticorps anti-ADN en ELISA. La fixation de F14-6 sur les lymphocytes et les cellules CHO est inhibée par la calréticuline soluble. Ainsi, les anticorps anti-ADN utilisés dans cette étude se fixent sur la calréticuline, suggérant que celle-ci pourrait jouer un rôle dans leur pénétration intra-cellulaire et par conséquent dans la pathogénèse du lupus.

Étude des anticorps catalytiques associés au lupus érythémateux systémique (Barbara Mouratou et Jean-Luc Guesdon)

L'objectif de ce travail est de définir le rôle physiologique des anticorps anti-ADN catalytiques présents dans les sérums des patients atteints de lupus érythémateux systémique (LES), maladie auto-immune, et capables de catalyser l'hydrolyse de la liaison phosphodiester des acides nucléiques. La lignée de souris F1 NZB/NZW, connue pour présenter spontanément un LES, a été choisi comme modèle d'étude. Une méthode rapide de criblage (catELISA) permettant de détecter avec efficacité la présence d'anticorps catalytiques dans un grand nombre d'échantillons, a été développée. Le criblage des 1284 hybridomes obtenus par fusion des cellules spléniques de dix souris femelle lupiques, qui a débuté récemment, à l'aide de notre catELISA a déjà permis de sélectionner de surnageants contenant potentiellement des anticorps anti-ADN catalytiques.

Mise au point de réactifs immunologiques issus du génie génétique (Serge Pauillac et Jean-Luc Guesdon)

La technique de préparation d'hybridomes murins par immunisation de souris suivie de la fusion des cellules immunocompétentes avec des cellules myélomateuses histocompatibles (Kholer et Milstein, 1975) permet la production illimitée de réactifs standardisés utilisables en clinique et en recherche fondamentale ou appliquée. La spécificité et l'affinité de ces réactifs peuvent être modulées par les techniques de biologie moléculaire impliquant plusieurs cycles de mutation et de sélection. Alternativement de tels réactifs peuvent être recherchés par la technique du "phage display" grâce au criblage de grandes banques de fragments d'anticorps (single chain Fv ou scFv) exprimés à la surface des phages filamenteux.

Ces deux voies seront explorées pour la production de protéines hybrides (scFv-PhoAv) composées d'un variant bactérien de phosphatase alcaline (PhoAv) couplé à divers fragments scFv spécifiques des entérotoxines de staphylocoques (collaboration avec l'Unité des Toxines Microbiennes, AFSSA, Maisons-Alfort) ou de toxines marines (exemple : la saxitoxine, responsable de l'intoxication paralytique par les fruits de mer).

Production d'anticorps monoclonaux murins (Farida Nato)

Dans le cadre de collaborations avec les chercheurs de l'Institut Pasteur, le laboratoire assure la préparation d'hybridomes murins en utilisant la technique développée par Köhler et Milstein (1975). Outre l'intérêt que les anticorps monoclonaux peuvent présenter dans certains secteur de diagnostic, ils sont aussi largement utilisés pour analyser la relation sturcture-fonction de divers modèles étudiés en Recherche Fondamentale. Les caractéristiques biochomiques (isotypes, mesure des afffinités, recherche des épitopes) des anticorps produits par les hybridomes sont déterminées dans le laboratoire par des techniques immunochimiques.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

ESNARD Muriel – I.P. (mesnard@pasteur.fr)

DEMANGEL Caroline, I.P., actuellement en stage post-doctoral.

GUESDON Jean-Luc, I.P. (guesdon@pasteur.fr)

LEDUC Mireille, Université Paris XI Orsay. (mleduc@pasteur.fr)

LAFAYE Pierre, I.P. (plafaye@pasteur.fr)

MAZIE Jean-Claude, I.P. (jcmazie@pasteur.fr)

MOURATOU-PECORARI Barbara, I.P. (Boursière, Fondation Roux), (mouratou@pasteur.fr)

EHSANI Parastoo, Chercheur, Institut Pasteur de l'Iran.

FEKI Salma, Etudiante en thèse, Faculté des Sciences de Tunis.

LECALVEZ Florence, INSA de Lyon.

PAUILLAC Serge, Chargé de Recherche, Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés

NATO Farida, I.P., Ingénieur.

SEDDIKI-SI AHMED Nabila, I.P., Ingénieur.

DARTEVELLE Sylvie, I.P., Technicienne.

JEANNEQUIN Odile, I.P., Technicienne.

ROUYRE Sylvie, I.P., Technicienne


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