Notre Unité étudie les bases moléculaires et cellulaires du pouvoir pathogène de Listeria monocytogenes, une bactérie responsable d'infections alimentaires graves qui est devenue un système modèle pour comprendre le parasitisme intracellulaire et l'exploitation des fonctions cellulaires par les pathogènes. L. monocytogenes est responsable de gastro-entérites, de septicémies, de méningites et d'avortements chez l'homme et certains animaux. La mortalité s'élève à 30 %. Les sujets à risque sont les femmes enceintes et les enfants à naître, les nouveaux nés et les personnes âgées, ainsi que les sujets immunodéprimés. L. monocytogenes a la capacité de traverser la barrière intestinale puis les barrière hémato-encéphalique et fœto-placentaire. In vitro, L. monocytogenes a la capacité d'entrer dans de nombreux types cellulaires et de s'y multiplier. Après lyse de la vacuole de phagocytose, les bactéries se répliquent, se déplacent dans le cytosol et passent de cellule en cellule en utilisant un mode de propulsion original : la polymérisation de l'actine cellulaire à l'un des pôles bactériens. En 2001, notre activité a porté sur l'étude des bases moléculaires de l'entrée dans les cellules in vitro et in vivo, l'analyse des vacuoles de phagocytose, l'étude des mouvements intra- et intercellulaires, la régulation de l'expression des gènes de virulence, l'identification de nouveaux gènes de virulence, et la comparaison des séquences des génomes de L. monocytogenes et de L. innocua. Nous avons aussi débuté des projets de type post-génomique (génétique fonctionnelle, étu de du transcriptome et poursuivi l'étude de la motilité actine-dépendante de Rickettsia conorii, une autre bactérie intracellulaire.

L'étude des deux protéines bactériennes impliquées dans l'entrée dans les cellules, l'internaline (ou InlA) et InlB, a été poursuivie. L'internaline est impliquée dans l'entrée dans les cellules exprimant la E-cadhérine, qui sont principalement les cellules d'origine épithéliale. InlB permet l'entrée dans un grand nombre de types cellulaires.

(M. Lecuit, S. Sousa)

Le récepteur de l'internaline a été identifié par chromatographie d'affinité. Il s'agit de la E-cadhérine. L'internaline interagit avec la E-cadhérine humaine, de poulet ou de cobaye mais pas avec la E-cadhérine murine ou celle de rat. L'unique acide aminé critique pour cette spécificité est l'acide aminé 16, qui est une proline dans les espèces permissives et un acide glutamique dans les espèces non permissives. Ces résultats expliquent pourquoi l'internaline ne joue aucun rôle dans le modèle d'infection murin. Nous avons analysé le rôle de l'internaline chez le cobaye ainsi que chez des souris transgéniques exprimant la E-cadherine humaine, générées en collaboration avec C. Babinet (Unité de Biologie du développement, Institut Pasteur). A l'aide de ces deux modèles, nous avons démontré le rôle critique de l'internaline dans la traversée de la barrière intestinale par L. monocytogenes. Il s'agit du premier modèle transgénique d'une infection humaine ayant permis l'identification d'un facteur de virulence bactérien. Nous étudions actuellement le rôle de l'internaline dans la traversée des barrières hémato-encéphalique et fœto-placentaire. Nous avons également analysé le rôle du domaine cytoplasmique de la E-cadhérine dans l'entrée en générant des lignées de fibroblastes exprimant des E-cadhérines variantes, portant différentes délétions du domaine cytoplasmique. Nous avons démontré que la E-cadhérine doit être connectée au cytosquelette d'actine par les caténines pour permettre l'entrée. Nous étudions actuellement les évènements précoces permettant l'entrée, et tentons d'identifier toutes les protéines cellulaires impliquées dans la polymérisation d'actine et le remodelage de la membrane plasmique au site d'entrée. Nous nous interessons notamment au rôle de la vézatine, un ligand de la myosine VIIA recrutée aux jonctions adhérentes par l'alpha-caténine.

(H. Bierne, S. Dramsi, R. Jonquières, N. Khelef)

InlB est associée d'une façon labile à la surface de la bactérie. Cette association originale s'effectue par sa partie C-terminale, composée de motifs répétés de 80 acides aminés commençant par le dipeptide GW. Ce domaine interagit de façon non covalente avec les acides lipotéchoiques de la bactérie. L'un des récepteurs d'InlB est le gC1q-R. Il a été identifié par chromatographie d'affinité. gC1q-R est le récepteur de la forme globulaire du C1q, le premier composant de la cascade du complément. Cette protéine n'a pas de domaine transmembranaire ni de domaine cytoplasmique, ce qui implique l'existence d'un co-récepteur afin qu'un relais avec le cytosol puisse avoir lieu. Un possible co-récepteur est Met, le récepteur de l'HGF ou " scatter factor ", qui appartient à la famille des récepteurs aux facteurs de croissance à activité tyrosine kinase. Ce récepteur interagit avec la région N-terminale d'InlB, la partie LRRs. Nous étudions actuellement les rôles respectifs de Met et de gC1p-R au cours de l'entrée et les évènements qui ont lieu après l'entrée ainsi que l'interaction éventuelle entre ces deux co-récepteurs. Nous avons aussi entrepris l'étude de la synergie potentielle entre l'internaline et InlB au cours de l'entrée.

Nous avons montré récemment que les répétitions GW pouvaient aussi interagir directement avec les cellules, par le biais des glycosaminoglycanes. Le mécanisme de cette interaction et son rôle au cours du processus infectieux sont actuellement à l'étude.

(H. Bierne, S. Dramsi, R. Jonquières, N. Khelef)

Nous avons montré que la protéine InlB purifiée active la PI 3-kinase par l'intermédiaire de son récepteur Met en stimulant la phosphorylation de trois protéines adaptrices, Gab1, Cbl et Shc. InlB est le premier agoniste bactérien de la PI 3-kinase. Alors que les bactéries entrent dans les cellules sans produire d'importants réarrangements du cytosquelette d'actine, InlB soluble produit des replis membranaires et une polymérisation spectaculaire de l'actine. Nous analysons les mécanismes permettant ces réarrangements, et avons mis en évidence les rôles du complexe Arp 2/3, du couple cofiline-LIM-kinase et ceux des GTPases de la famille Rho, qui sont impliquées dans la régulation de la polymérisation de l'actine. Nous recherchons aussi les cibles des produits de la PI 3-kinase. En aval de l'activation par InlB de l'activité PI-3 kinase, la PLC-gamma est stimulée, induisant la production d'IP3 et la libération des stocks de calcium intracellulaire. Cependant, la PLC-gamma n'a pas de rôle direct au cours de l'entrée et pourrait intervenir au cours d'évènements plus tardifs. InlB est aussi capable d'activer NF-kB, ce qui pourrait conférer à lnlB des propriétés anti-apoptotiques. Cet effet potentiel d'InlB est actuellement étudié. Comme tous ces résultats l'illustrent, InlB est une protéine bactérienne ayant une activité de signalisation assez exceptionnelle.

(J. Pizarro-Cerda)

Afin d'identifier les molécules clés pour l'internalisation de L. monocytogenes dans les cellules ainsi que pour la maturation de la vacuole d'internalisation, nous utilisons une approche de type lipido/protéomique et avons entrepris d'analyser la composition moléculaire des vacuoles d'internalisation de Listeria. Les vacuoles sont isolées par fractionnement subcellulaire après interaction des cellules avec des billes latex recouvertes d'InlA ou InlB, ou par cytométrie de flux après interaction des cellules avec L. monocytogenes. La composition protéique de ces phagosomes est analysée après electrophorèse en gels bidimensionnels par spectrométrie de masse. Par cette approche, nous avons mis en évidence l'association de la septine MSF avec les phagosomes contenant les billes de latex recouvertes d'InlB. MSF est une GTPase capable de former de filaments qui colocalisent avec le cytosquelette d'actine. Actuellement nous étudions le rôle de son domaine GTPase dans l'entrée de Listeria dans les cellules cibles. Nous avons également identifié la présence d'une PI 4-kinase associée préférentiellement aux phagosomes contenant les billes recouvertes d'InlB dont le rôle dans le processus d'internalisation de Listeria est en cours d'analyse.

(E. Gouin, V. Villiers)

Nous poursuivons l'étude de la protéine de surface ActA. Par une approche génétique couplée à une approche biochimique menée en collaboration avec MF Carlier (CNRS, GIF/Yvette), nous avons analysé l'interaction d'ActA avec le complexe Arp2/3 et montré qu'ActA mime les protéines de la famille WASP.

R. conorii est une bactérie intracellulaire stricte qui possède une motilité dépendante de la polymérisation de l'actine, comme L. monocytogenes, S. flexneri ou le virus de la vaccine. Son mécanisme de polymérisation d'actine semble cependant original, puisque les filaments d'actine polymérisée sont longs, non branchés, fixés sur la bactérie et ne contiennent pas le complexe Arp2/3. Le séquençage du génome de R.conorii au Génoscope d'Evry est achevée.

Les données actuelles font apparaître un gène candidat impliqué dans la motilité actine dépendante dont nous analysons la fonction.

(J. Johansson, A. Renzoni)

La protéine PrfA est un activateur pléiotrope de la transcription de la majorité des gènes de virulence de L. monocytogenes. La régulation de l'expression de cette protéine est complexe. Dans certaines conditions environnementales où les gènes de virulence sont réprimés, la protéine peut être présente mais inactive. L'expression de la protéine est augmentée en présence des cellules hôtes ou d'extraits cellulaires. Nous recherchons le(s) signal(aux) cellulaires responsables de cette induction. Nous nous interessons également aux mécanismes moléculaires de la régulation de PrfA par la température ainsi qu'aux modifications post-traductionnelles (fixation d'un cofacteur…) de PrfA pouvant affecter sa fonction. Nous étudions aussi d'autres protéines qui pourraient avoir une activité de régulateur transcriptionnel.

(F. Bourdichon, S. Dramsi, H. Fsihi)

Pour identifer de nouveaux gènes de L. monocytogenes indispensables au processus infectieux de L. monocytogenes in vivo dans le modèle expérimental murin, nous avons utilisé une approche génétique appelée mutagénèse STM ou "Signature-tagged mutagenesis'. Nous avons construit une banque de mutants de L. monocytogenes étiquetés à l'aide de 96 transposons différents. Ces mutants ont été utilisés pour infecter des souris et les mutants présents dans l'inoculum initial et absents dans les tissus après plusieurs jours d'infection, et donc incapables de survivre chez la souris ont été analysés. Les gènes mutés ont été identifiés. Leur fonction respective est actuellement en cours d'analyse.

(H. Bierne, D. Cabanes, O. Dussurget, P. Dehoux, E. Milohanic)

En collaboration avec le Laboratoire de Génomique des Pathogènes (P. Glaser, C. Buchrieser et L. Frangeul) et un consortium européen, nous avons annoté et comparé les génomes de L. monocytogenes et L. innocua, une espèce non pathogène du genre Listeria. Une analyse transcriptionnelle dans différentes conditions de croissance est menée pour caractériser les gènes dont l'expression est régulée dans les conditions environnementales rencontrées par L. monocytogenes. Nous analysons aussi par cette approche transcriptomique, les gènes régulés par PrfA et qui sont sans doute de nouveaux gènes de virulence. Une étude de la variabilité de ces résultats dans différents isolats est aussi entreprise. Enfin en collaboration avec le groupe de P. Martin (Laboratoire des Listeria), nous avons entrepris l'analyse d'un grand nombre de souches de L. monocytogenes de différents sérovars afin d'identifier tous les gènes responsables du pouvoir pathogène de L. monocytogenes.

D'autre part, nous inactivons des gènes présents chez L. monocytogenes et absents chez L. innocua afin d'identifer de nouveaux gènes de virulence. Les gènes ciblés en priorité codent pour des protéines de surface. Les travaux en cours montrent que certaines de ces proteines pourraient jouer un rôle pour l'entrée dans les cellules. Nous avons également inactivé un gène qui code pour une hydrolase des sels biliaires. C'est un nouveau facteur de virulence qui semble jouer un rôle dans la survie des bactéries chez l'hôte infecté.

L'inactivation du gène srtA, codant pour la sortase A de L. monocytogenes, abolit l'ancrage de plusieurs protéines de surface de la famille LPXTG et affecte la virulence. Les rôles précis de ce gène et du gène paralogue srtB sont à l'étude.

Photo 1: Comète d'actine de Rickettsia conorii [Rickettsia conorii actin tails]

Photo 2: Entrée de L. monocytogenes dans les cellules Caco-2 (microscopie électronique à balayage) [L. monocytogenes in Caco-2 cells (Scanning electron microscopy]

Isabelle Carton, Secrétaire IP

DUSSURGET Olivier, CR1 IP

SEVEAU Stéphanie, Stagiaire post-doctorant ARC

VILLIERS Véronique, Technicienne IP