Les travaux du laboratoire sont destinés à mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la du maintien de l'homéostasie de la différenciation des barrières épithéliales en fonction des modifications du micro-environnement , en particulier les infections par des micro-organismes pathogènes.et les réponses du système immunitaire muqueux sous-jacent. Nous étudions dans un modèle en culture lde plaques de Peyer, la nature, la synthèse et le routage apical des récepteurs responsables de l'adhésion de certains pathogènes, et les régulations géniques spécifiques de la cellule M.

Les travaux du laboratoire sont destinés à mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la du maintien de l'homéostasie de la différenciation des barrières épithéliales en fonction des modifications du micro-environnement , en particulier les agressions du contenu luminal, (infections par des micro-organismes pathogènes, modifications physique-chimiques), et les réponses du système immunitaire muqueux sous-jacent. Nous avons choisi, pour étudier les mécanismes moléculaires régissant la réactivité des cellules épithéliales au micro-environnement, le paradigme de la cellule M des plaques de Peyer's intestinale et la métaplasie intestinale observée dans l'épithélium Malpighien de l'œsophage lors de reflux acide récurrents (syndrome de Barrett).Dans le tractus intestinal, l'échantillonnage des antigènes, prélude au déclenchement d'une réponse immunitaire locale ou systémique, a lieu majoritairement au niveau de régions spécialisées appelées plaques de Peyer. Elles sont constituées de follicules lymphoïdes recouverts par un épithélium particulier contenant un type de cellules particulier, les cellules M, qui ont la capacité de transporter toutes sortes de particules, bactéries et virus présents dans la lumière intestinale et de les délivrer intacts au niveau du follicule lymphoïde sous-jacent. Ces particules et micro-organismes sont alors capturés et traités par les cellules dendritiques et les macrophages muqueux, étape initiale du déclenchement d'une réponse immunitaire locale ou de l'acquisition d'une tolérance.En raison de la rareté des cellules M dans l'épithélium intestinal, les études biochimiques sont à ce jour impossibles. La biologie cellulaire et moléculaire des cellules M est donc largement inconnue.Un système de co-culture "in vitro" a été développé au laboratoire en mettant en contact des cellules intestinales humaines immortalisées et des lymphocytes. Les entérocytes se transforment en cellules ayant acquis les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cellules M. Ceci permet donc de reconstituer les étapes précoces de l'infection (franchissement de la barrière muqueuse) dans un système simplifié où les paramètres sont contrôlés. Le modèle de cellules M en culture permet de compléter les études immunomorphologiques effectuées in vivo par des données cinétiques et la possibilité d'utiliser les méthodologies de biologie cellulaires , moléculaires et de biochimie.

Ce projet est abordé selon quatre approches convergentes utilisant la biologie cellulaire, la biologie moléculaire et les régulations trans criptionnelles , et la microbiologie.

1. Les études cinétiques et la caractérisation moléculaire de l'interaction micro-organismes/cellules M et l'identification des récepteurs présents dans la membrane apicale des cellules M. (travaux menés par Sophie Kernéis). Une première série de résultats est soumise pour publication :

Des études menées in vivo, par infection d'anses intestinales ligaturées ou par infection orale d'animaux, ont permis d'identifier différentes familles de bactéries définies selon leur mode d'interaction avec les cellules M; (i) adhésion stricte de la bactérie sans transport de celle-ci, (ii) adhésion et transport suivis d'une destruction de la bactérie, (iii) adhésion et transport puis dissémination de celle-ci, (iv) adhésion de la bactérie suivie de la destruction de la monocouche épithéliale (Siebers et Finlay, 1996). S'il est clair que les pathogènes ont des comportements différents vis-à-vis des cellules M, leurs mécanismes moléculaires d'interaction avec ces cellules demeurent inconnus; une des questions posées concerne la nature des molécules impliquées dans l'adhésion, et le type de mécanisme qui conduit au transport de ces pathogènes. De la première partie de cette étude, il ressort que les profils d'adhésion des différentes bactéries testées diffèrent selon les souches bactériennes testées et selon le type cellulaire considéré (entérocyte ou cellule M). L'analyse des taux de translocation des bactéries au travers du modèle en culture de cellules M montre des facteurs d'augmentation très significatifs (100 à 400) par rapport aux taux de translocation observés dans lesentérocytes en culture, pour 4 des 5 souches testées. Seule Listeria monocytogenes ne semble pas être transportée plus efficacement dans le système de co-culture. Le fait de pouvoir observer selon les bactéries considérées, des comportements différents vis-à-vis des cellules M (apparition de sites d'adhésion pour Yersinia enterocolitica, absence de translocation de Listeria monocytogenes) laisse à penser que le phénomène de translocation des bactéries par les cellules M ne soit pas strictement passif. Il est possible que les cellules M assurent une translocation non spécifique à bas niveau de nombreuses substances (billes de latex, antigènes, peroxydase, Listeria, ...) et que certains pathogènes activeraient certaines voies cellulaires permettant d'augmenter cette activité de transport à leur profit. Il nous semble maintenant fondamental d'aborder par des techniques biochimiques l'identification des molécules eucaryotes impliquées dans cette translocation.

L'invasine, protéine codée par un gène chromosomique, est impliquée dans le processus d'invasion de Y. enterocolitica. Cette protéine se lie aux intégrines b1 localisées au pôle basolatéral des cellules entérocytaires. Les questions posées sont les suivantes : - l'intégrine b1 apicale provient-elle d'une redistribution de la forme basolatérale ou est-elle néosynthétisée ? - Quelle chaîne a lui est associée, et joue-t-elle un rôle dans le routage apical ?

En combinant les méthodes d'immunocytochimie, de Western blot, de biotinylation sélective apicale ou baso-latérale et d'immunoprécipation, nous avons démontré qu'il existait un pool important d'intégrine b1 intracellulaire dans la lignée de cellules épithéliales intestinale. Lorsque ces cellules sont co-cultivées avec des lymphocytes de plaques de Peyer, ce pool intracellulaire disparaît et la totalité de l'intégrine b1 se relocalise dans les membranes basolatérales et apicales. L'mmunoprécipitation de l'intégrine b1 sur des extraits protéiques de cellules intestinales et de coculture avec des lymphocytes de plaques de Peyer montre l'augmentation relative des formes matures membranaires (130 kDa) et la diminution relative des formes immatures intra-cytoplasmiques (110 kDa) après co-culture. L'immunoprécipitation de l'intégrine après biotinylation sélective des protéines de la surface apicale nous confirme l'augmentation de l'expression membranaire apicale de l'intégrine b1 dans les co-cultures. L'expression des chaînes alpha été étudiée dans les mêmes conditions. La chaîne a associée à l'intégrine b1 au pôle apical des cellules Caco-2 s'est avérée être l'intégrine a2. L'étude des chaînes alapha associées à l'intégrine beta-1 au pôle apical des co-cultures a montré que ni alpha-4, alpha-5, alpha-6 et alpha-V ne sont néo-synthétisées (" pulse et pulse-chase "). Seule une augmentation faible d'alpha-2 est observée alors qu'un signal très elevé est detecté en electrophorèse 2D par la streptavidine. Ceci montre qu'il existe une autre chaine a associée aux intégrines b1 et participant à l'adhésion de Y. enterocolitica. Son identification est en cours.

3. Les régulations transcriptionelles associées à la conversion des cellules de l'épithélium intestinal en cellules de type M et la recherche de facteurs de transcription spécifiques qui à terme permettront d'identifier une grande part des gènes cibles associés aux fonctions d'adhésion sélective des micr-organismes et à leur translocation. Ces travaux sont menés par Sophia EL Bahi, étudiante en Thèse.

La question posée est la suivante: les lymphocytes de plaques de Peyer (LPP) exercent-ils un effet sur les régulations transcriptionelles des cellules intestinales? Pour y répondre, nous disposons de deux promoteurs tissu-spécfiques: le promoteur de la sucrase isomaltase (enzyme de la bordure en brosse des entérocytes, absente dans les cellules M) et le promoteur modifié de la pyruvate-kinase . L'activité de ces promoteurs a été étudiée en présence de LPP, nécessaires à la formation des cellules M. Nous avons étudié l'activité du promoteur de la SI (couplé au gène rapporteur GFP) dans le de cellules M in vitro, et montré que l'absence de cette enzyme à l'apex des cellules M est dû au moins en partie à une régulation transcriptionelle négative de ce gène. En présence de lymphocytes (co-culture), l'expression en GFP est diminuée d'un facteur 2,7. Après transfection du gène de la b-Gal sous control du promoteur modifié de la pyruvate-kinase les cellules intestinales cultivées en présence de lymphocytes de plaques de Peyer voient l'expression du gène rapporteur lacZ augmentée d'un facteur de 4,4. Il s'agit d'un résultat-clé pour la suite de nos études puisqu'il démontre pour la première fois l'existence de régulations transcriptionnelles positives dans les cellules M. C'est un outil unique pour identifier des facteurs de transcription spécifiques. L'identification des facteurs de transcription exprimés au niveau des cellules M, puis de leurs gènes cibles, contribuera de façon efficace à la caractérisation moléculaire et cellulaire de ces cellules épithéliales, jusqu'alors caractérisées de façon morphologique et fonctionnelle. La construction de la banque de cDNA des cellules de type M aura plusieurs applications: l'identification de molécules impliquées dans l'adhérence, le transport et la délivrance des micro-organismes au niveau des follicules lymphoïdes ou le remaniement du cytosquelette. Par ailleurs en trouvant des marqueurs, il sera beaucoup plus aisé d'étudier les cellules M, in vivo ou sur des explants d'intestin. Ce projet permettra in fine de mieux comprendre la biologie cellulaire et moléculaire contrôlant les interactions hôte/micro-organismes et donc les étapes précoces de nombreuses infections bactériennes et virales au niveau de l'axe intestin-colon-rectum.

Pour accéder à l'étude du mécanisme moléculaire responsable des étapes précoces de la métaplasie intestinales de l'EB, nous développons un système en culture de kératinocytes œsophagiens sur des filtres poreux, qui seront ensuite soumis à divers changements du micro-environnement (pH, co-culture avec des lymphocytes). Nous tentons d'identifier le ou les facteurs inducteurs de la conversion de l'épithélium pluristratifié en épithélium de type intestinal, en étudiant l'induction de Cdx1, Cdx2 et la disparition des mucines spécifiques de l'œsophage au profit des mucines intestinales. Ce type d'étude en cours n'est possible que dans un environnement contrôlé, et donc impossible à réaliser dans les modèles animaux. Des explants d'œsophage de souris normale Balb/c ont été mis en culture. Après 11 passages on obtient une culture homogène de phénotype épithélial qui parvient à confluence. Un double marquage immunocytochimique montre un empilement des cellules épithéliales, la couche inférieure exprimant la CK 14, marqueur de la couche basale de cellules souches dans le tissu normal, et la couche supérieure co-exprimant la CK14 et la CK4, marqueur des cellules suprabasales en différenciation. Ceci démontre que nous avons réussi à cultiver à long terme des kératinocytes œsophagiens capables de former une multicouche qui se différencie. Les cultures ont été transfectées par la region régulatrice du gène de cdx2 (homeogène spécifique de la différenciation des entérocytes) couplée à la GFP (gène rapporteur). Les courbes de croissance à pH 7.4, 5.0 et 3.5 ont été réalisées. Le pH 3.5 semble délétère pour les cultures, qui en revanche se maintiennent parfaitement à pH 5.0. Toutefois une diminution de l'expression de la CK4 est observée à pH 5.0, et l'apparition d'ilôts de cellules exprimant la GFP témoigne de l'activation de l'homéogène intestinal cdx2. Il semble qu'il ait donc sous l'effet d'une agression acide modérée, un changement du programme génétique des kératinocytes vers un programme " intestinal ", premier pas d'une métaplasie reconstituée in vitro. Ce travail a la voie aux cliniciens pour la détection précoce du Barrett dont souffrent 25% de la population et qui trop souvent dégénère en adéno-carcinome. Détection précoce en terme de pronostic, et espoirs d'idenfier des molécules capables de le juguler bien avant que les dysplasies et lésions carcinomateuses n'apparaissent. En terme de diagnostic, ce projet ouvre la perspective de développer en collaboration avec les gastro-entérologues des méthodes moins invasives que la fibroscopie qui n'est pas toujours bien acceptée et reste un examen couteux et dont la fiabilité, bien que très élevée, n'est néanmoins pas de 100% quand il est pratiqué en routine en médecine de ville.

Legends of Figures

Figure 1 : Vue en microscopie électronique à transmission d'une cellule M des plaques de Peyer. En bleu, un parasite. En marron, un lymphocyte logé dans une invagination membranaire de la cellule M.

Figure 2 : A :Co-culture de lymphocytes de plaques de Peyer dans une monocouche de cellules épitheliales intestinales. En rouge, marquage anti Ig (lymphocytes) . En vert, marquage de l'actine-F délimitant les cellules épithéliales. B : cinétique de translocation de billes de latex fluoescente. En rouge courbe obtenue dans le modèle de cellules M en culture. En noir , id. entérocytes (contrôle). C : plans xy et xz obtenus par microscopie confocale montrant une cellule M en culture contenant un lymphocyte (en rouge) et des billes de latex fluoscentes internalisées (en vert).

Figure 3 : Regulation transcriptionnelle de la disparition d'expression de sucrase-isomaltase dans les cellules M en culture. A : Western blot. B : quantification par STORM (1, contrôle ;2, cellules M en culture). C : augmentation de l'expression du transgene (LacZ) sous contrôle du promoteur PP-spécifique. D : Cellule M en culture (en rouge) exprimant la beta-galactosidase nucleaire (en bleu) et contenant des particules de latex internalisées en cours de transcytose (en vert)

Hamzaoui Nadim, Institut Pasteur, Médecin-chercheur (CDD).

El Bahi Sophia, étudiante en Thèse d’université, Bourse CANAM. elæis@pasqteur.fr

Caliot Elise, Institut Pasteur, Ingénieur de Recherche. ecaliot@pasteur.fr