Les activités de l'unité centrées sur la génétique moléculaire des virus à ARN positif ou négatif (virus grippaux, picornavirus, virus de de l'hépatite C), portent sur l'étude des mécanismes moléculaires de l'expression et de la réplication des génomes viraux et de leur emploi comme vecteurs d'expression, l'analyse des interactions fonctionnelles entre le virus et son hôte, l'étude de la variabilité des génomes viraux. Une équipe s'intéresse aux dysfonctionnements neurologiques et déficits cognitifs associés aux infections, notamment par le VIH.

a) Génétique moléculaire des complexes de transcription/réplication de virus grippaux (Nadia NAFFAKH, Pascale MASSIN, Bernadette CRESCENZO-CHAIGNE, Monika MARASCESCU)

Nous avons poursuivi l'identification, au sein des gènes codant pour le complexe de transcription/réplication, des déterminants moléculaires de la spécificité de type et de la spécificité d'espèce des virus grippaux en utilisant un système d'expression transitoire en cellules eucaryotes permettant d'exprimer les 3 sous-unités du complexe polymérase (PB1, PB2, et PA) ainsi que la nucléoprotéine NP, et de suivre la transcription/réplication d'un ARN pseudo-viral porteur d'un gène rapporteur. Nous avons montré que la nature de certains nucléotides ainsi que la stabilité de la structure secondaire des extrémités de l'ARN viral sont des déterminants importants de la spécificité de type et sont impliqués dans la reconnaissance par le complexe polymérase de façon variable selon la souche virale dont dérive le complexe polymérase.

L'étude des complexes polymérase issus de virus d'origine humaine et d'origine aviaire a permis de montrer que le résidu 627 de PB2 détermine la sensibilité du complexe polymérase à basse température, suggérant qu'une moindre capacité du complexe polymérase à assurer la réplication du génome viral à 33°C pourrait contribuer à l'incapacité des virus aviaires à se multiplier efficacement chez l'homme. Par ailleurs, nous avons observé que les niveaux de protéolyse induits par la sous-unité PA du complexe étaient variables selon l'origine de PA et que les deux activités liées à PA (protéolyse et transcription/réplication) n'étaient pas strictement corrélées.

b) Vecteurs viraux et vaccinologie (Nicolas ESCRIOU, Marco VIGNUZZI, Alexandre VIEIRA-MACHADO, Sylvie GERBAUD, Christophe BATEJAT)

Des réplicons dérivés du virus de la Forêt de Semliki (SFV), du poliovirus (PV) ou du Mengo virus (MV) permettant l'expression de la nucléoprotéine (NP) du virus grippal ont été obtenus. Après injection sous forme d'ARN nu à la souris, une immunité protectrice vis-à-vis d'une infection d'épreuve par le virus grippal a été démontrée pour les réplicons dérivés du SFV et du MV. La protection conférée est comparable à celle induite par immunisation génique avec un ADN plasmidique dirigeant l'expression de la NP. Par ailleurs, nous avons montré que des réplicons dérivés du génome du poliovirus permettent l'expression d'une protéine glycosylée telle que l'hemagglutinine (HA) du virus grippal lorsque l'expression de la HA est découplée de celle du reste de la polyprotéine du poliovirus par l'insertion d'un IRES dans une construction bicistronique.

Par génétique inverse, des virus grippaux transfectants porteurs d'un segment bicistronique dérivé du segment 6 codant pour la neuraminidase (NA) ont été obtenus selon deux stratégies. La première qui repose sur l'insertion de la séquence IRES du gène BiP permet de rendre le segment dicistronique pour la traduction des ARN messagers correspondants. La deuxième consiste en une duplication des séquences 3' non-codantes du segment d'ARN génomique rendant le segment dicistronique pour la transcription/réplication puisqu'il dirige alors la synthèse de vARN, cARN et mARN génomiques et subgénomiques. L'étude des conditions d'expression de différents gènes rapporteurs, comme CAT et GFP, nous a permis d'établir la supériorité de la deuxième approche et de montrer que la taille de l'insert affecte négativement la viabilité des virus.

Spécificité d'interaction de l'hémagglutinine (HA) des virus grippaux A(H3N2) avec le récepteur, l'acide sialique. (Rita MEDEIROS, Nadia NAFFAKH, Nicolas ESCRIOU, Jean-Claude MANUGUERRA)

Partant de l'observation initiale que les isolats récents de virus grippaux A(H3N2) ont perdu la capacité d'agglutiner les globules rouges de coq, nous avons montré que cette propriété dépend notamment de la nature du résidu de la HA en position 226. Des variations séquentielles de ce résidu sont observées depuis l'introduction chez l'homme des virus A(H3N2) à l'origine de la pandémie de 1968. Ces variations ne sont pas corrélées à un changement de spécificité vis-à-vis des acides sialiques en liaison SAa2,6Gal, mais pourraient plutôt altérer l'affinité de la HA pour ces récepteurs et ainsi contribuer à l'adaptation du virus à son hôte. Parallèlement, nous poursuivons l'étude d'une substitution du résidu 193, très conservé au sein de chaque groupe de virus infectant un hote spécifique, qui semble impliquée dans la spécificité de la HA vis-à-vis des acides sialiques en liaison SAa2,3Gal.

L'analyse phylogénétique des gènes du complexe polymérase (PB1, PB2, PA) de virus grippaux équins A(H3N8) isolés en France entre 1993 et 1999 suggère une évolution linéaire et montre l'appartenance au même lignage que la souche A/Eq/London/1416/73(H7N7), en accord avec l'hypothèse d'un évènement de réassortiment entre virus équins A(H7N7) et A(H3N8) se traduisant par la substitution des gène internes. Par ailleurs, une évolution plus rapide des gènes PA par rapport aux gène PB1 et PB2 a été observée.

Parallèlement, des prélèvements de l'avifaune ont été réalisés. Des virus grippaux aviaires ont été isolés et sont en cours de caractérisation.

d) Centre National de Référence de la Grippe (France-Nord) et Centre collaborateur de l'OMS pour la référence et la recherche sur les virus grippaux et les autres virus respiratoires (Sylvie van der WERF, Jean-Claude MANUGUERRA, Maryse TARDY-PANIT, Valérie LORIN, Claudine ROUSSEAUX, Valérie SEFFER)

A ce titre, l'unité contribue à la surveillance des virus grippaux et d'autres virus respiratoires au niveau national par le biais du réseau de laboratoires hospitaliers RENAL et du réseau des GROG (Groupes Régionaux d'Observation de la Grippe), et au niveau européen, par échange télématique des données dans le cadre du groupe EISS (European Influenza Surveillance Scheme), et par l'animation du réseau EUROGROG. L'isolement, l'identification et la caractérisation antigénique des virus respiratoires sont réalisés à partir des prélèvements de cas d'infections respiratoires de type syndrome grippal adressés au Centre. Au cours de la saison 2000/2001, l'épidémie de grippe a été peu intense. Les virus A(H1N1) ont largement prédominé et ont été caractérisés comme antigéniquement apparentés à la souche A/New Caledonia/20/99(H1N1) inclue dans la composition vaccinale. Des virus de type B, généralement proches mais antigéniquement distincts de la souche vaccinale B/Yamanashi/166/99, ont circulé plus tardivement au cours de la saison.

Pour pallier l'absence de système cellulaire permettant la multiplication du VHC in vitro et de modèle animal autre que le chimpanzé, nous avons recours au virus GBV-B, dont l'organisation génomique est la plus proche de celle du VHC parmi les Flaviviridae. De plus, ce virus infecte le tamarin (petit primate), est hépatotrope, et se multiplie ex vivo dans des cultures d'hépatocytes primaires de tamarin. Plusieurs clones moléculaires GBV-B/VHC hybrides ont été obtenus par échange de séquences codant pour tout ou partie des protéines structurales, dans le but d'identifier les déterminants moléculaires de la spécificité d'hôte de ces virus et de produire des outils pour l'étude de l'infection à VHC et de la biologie du VHC chez le tamarin. Nous avons montré que les polyprotéines hybrides correspondantes sont découpées de façon fidèle. Nous évaluons la possibilité d'assembler en pseudo-particules les polypeptides issus des précurseurs structuraux chimères à l'aide de baculovirus recombinants. D'autres clones moléculaires hybrides générés par échange de certains déterminants viraux de la réplication, comme la protéinase virale majeure ou les séquences (IRES) permettant l'initiation de la traduction par entrée interne des ribosomes, devraient, outre leur intérêt pour l'étude de la réplication du VHC in vivo, permettre l'évaluation d'antiviraux chez le petit primate (coll. S.M. Lemon, UTMB, Galveston, TX, USA). L'infectivité de de ces génomes chimères est à l'étude après inoculation intrahépatique chez le tamarin.

III. "Déficits cognitifs associés à différentes neuropathologies: neuroSIDA, neuropaludisme et schizophrénie."

Etudes fonctionnelles de modèles animaux de neuropathologies infectieuses et parasitaires : anatomo-pathologie, imagerie cérébrale (IRM) et spectroscopie de résonance magnétique in vivo, comportement.

- Modèle de l'encéphalite et de la démence associées au SIDA chez le rat

- Modèle murin de neuropaludisme

Etudes cliniques : Imagerie Cérébrale Fonctionnelle (IRMf) et tests neuropsychologiques dans les pathologies des fonctions cognitives.

- Les troubles cognitifs associés au SIDA

- Les troubles cognitifs dans la Schizophrénie

NAUBRON Christine, secrétaire de direction

van der WERF Sylvie,Université Paris 7, PR1 & Institut Pasteur, Chef de Laboratoire, svdwerf@pasteur.fr

VIGNUZZI Marco, doctorant

CLAVEL Sandrine, Institut Pasteur, Aide de Laboratoire