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  Responsable : BUCKINGHAM Margaret (margab@pasteur.fr)


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Nos recherches sont centrées sur l'étude de la myogenèse dans le but de comprendre comment les cellule progénitrices sont spécifiées chez l'embryon pour permettre la mise en place de différentes masses musculaires du squelette et du cœur pendant le développement. Nous sommes également intéressés par les cellules progénitrices du muscle chez l'adulte et la contribution de cellules souches à la régénération. Le modèle expérimental est la souris, avec manipulation de gènes de régulation myogénique.



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La formation du muscle de squelette [Lola Bajard, Ted Chang, Philippe Daubas, Jacqueline Perreau, Frédéric Relaix, Didier Rocancourt, Ralf Spörle, Shahragim Tajbakhsh (groupe indépendant depuis 10/01) — collaborations avec les laboratoires de G. Cossu, P. Maire, A. Mansouri, T. Partridge, M. Polimeni, P. Rigby, , B. Schäfer]

En 1997 nous avions démontré que Myf5 et Pax3 se situent en amont de MyoD dans la hiérarchie génétique qui régule la myogenèse. Actuellement nos recherches se focalisent sur la régulation et la fonction de ces deux gènes.

Nous analysons la régulation du gène Myf5 par une approche de transgenèse chez la souris, en utilisant des YACs portant de grands fragments d'ADN autour du gène. Ainsi plusieurs régions allant jusqu'à 96 kbp en amont de Myf5 ont été identifiées comme étant nécessaires pour différents aspects de l'expression spatiotemporelle du gène. Plusieurs enhanceurs ont été mis en évidence dont un situé à —58/-48 kbp du gène Myf5, composé de sous élements distincts, qui dirige l'expression d'un gène rapporteur (nlacZ) aux myotomes des somites, aux muscles du tronc et des membres, ainsi qu'aux régions du système nerveux central où nous avons mis en évidence auparavant une transcription inattendue de ce gène de régulation myogénique. L'activation précoce du gène dans les somites dépend d'un autre enhanceur situé à —6 kbp ; dans le contexte du locus (200 kbp), la délétion de cet élément élimine spécifiquement l'expression précoce dans le dermomyotome n'affectant pas la transcription myotomale, qui est donc la cible d'autres signaux myogéniques. Un autre élément à —17 kbp de Myf5 a aussi les propriétés d'enhanceur, dirigeant l'expression dans un sous-domaine du myotome qui nous intéresse particulièrement. Situé entre la partie épaxiale et la partie hypaxiale du somite, ce domaine intercalé du dermomyotome exprime les marqueurs tel Engrailed 1, impliqué dans la formation de frontières chez l'embryon. Récemment, nous avons pu identifier d'autres marqueurs qui permettent une analyse plus fine du comportement dynamique de cette région pendant la maturation des somites. La délétion de l'enhanceur à —17 kbp donne un résultat intéressant. Un deuxième gène myogénique, Mrf4, est situé à —6 kbp en amont de Myf5 et partage vraisemblablement certains des éléments de régulation tout en ayant un patron d'expression différent. L'introduction d'un deuxième gène rapporteur (la phosphatase alkaline) dans Mrf4, nous permet d'étudier le rapport de forces entre les deux promoteurs, Myf5 ou Mrf4, et d'autres éléments de régulation/enhanceurs. Nos résultats préliminaires suggèrent que l'élément à —17 kbp joue un rôle clé dans l'organisation du locus.

La manipulation génétique du gène Myf5, avec introduction d'un gène rapporteur nlacZ, nous a permis de démontrer le rôle de ce facteur dans le positionnement de cellules myogéniques requises pour la formation du myotome, aussi bien que dans le déclanchement de la cascade de régulation qui amène ensuite à leur différenciation. Les premiers mutants sont morts à la naissance d'une insuffisance respiratoire due à un défaut dans la formation des côtes. Une deuxième génération de mutants, avec le gène de sélection neo enlevé du locus, ne montrent plus ce phénotype et sont viables. L'analyse de ce phénomène indique qu'il dépent du positionnement ainsi que de la nature de l'insertion dans le locus. Il s'agit vraisemblablement d'un effet en cis sur un autre gène impliqué directement ou indirectement dans la formation des côtes. Les perturbations d'expression de Mrf4 sont corrélées avec le phénotype, suggérant que ce facteur, jouant un rôle clé dans la différenciation du muscle du myotome, pourrait être un candidat. Ces observations indiquent aussi à quel point les séquences qui régulent Mrf4 et Myf5, sont imbriquées dans le locus.

L'allèle Myf5-nlacZ est également exprimé dans les cellules satellites qui se trouvent le long des fibres musculaires chez l'adulte. L'activation de cellules satellites permet la régénération du muscle endommagé. Pax7 et/ou son orthologue Pax3, est également exprimé dans ces cellules. En 2000, M. Rudnicki et al. ont démontré que les cellules satellites sont absentes dans les muscles du membre chez un mutant Pax7 -/-. Au contraire de ce qui se passe pour la myogenèse chez l'embryon, Myf5 ne peut donc pas complémenter l'absence du Pax au niveau de la spécification des cellules précurseurs. Nous examinons le rôle de Pax3 dans les cellules satellites des muscles, tel le diaphragme où nous avons mis en évidence l'expression de ce gène. Comme dans le cas de Myf5, la manipulation du locus avec l'introduction de gènes rapporteurs nous permet de mieux étudier cette population cellulaire. Les souris ainsi modifiées nous permettent également de suivre les populations de cellules qui expriment Pax3 chez les embryons normaux et mutants.

Pax3 est exprimé dans le mésoderme présomitique aussi bien que dans les cellules progénitrices du muscle. L'introduction d'autres séquences dans le gène de Pax3 permet donc de cibler les événements précoces qui amènent à la formation du muscle, que cela soit au niveau des voies de signalisation qui activent les gènes de détermination myogénique, ou au niveau d'autres facteurs de transcription dans la cascade de régulateurs qui amènent à la formation du muscle.

Les voies de signalisation qui contrôlent l'initiation de la myogenèse ont déjà été étudiées au laboratoire. Les séquences régulatrices du gène Myf5 sont étudiées dans ce contexte. Pour mieux comprendre l'éventuel rôle de la voie de signalisation Notch dans la spécification de cellules musculaires nous avons ciblé un allèle des gènes Pax3 et Myf5 avec une séquence codante pour une forme intracellulaire de Notch, constitutivement activée. Les perturbations, particulièrement évidentes dans le cas de l'allèle Pax3, dans les cellules musculaires et les dérivés de la crête neurale, sont à l'étude.

Les membres de la famille d'homéoprotéines Six interviennent dans l'activation de gènes impliqués dans la différenciation musculaire et probablement aussi à une étape plus précoce, entre Pax3 et MyoD. Nous avons ciblé un allèle de Pax3 avec une séquence encodant une forme dominante négative de Six4 dans le but de mieux définir le rôle de ces facteurs en amont de la formation du muscle. Les embryons qui portent cet allèle sont en cours d'analyse.

Cardiogenèse [Robert Kelly, Marguerite Lemonnier, Sigolène Meilhac, Stéphane Zaffran — collaborations avec les laboratoires de N. Brown et J.-F. Nicolas]

L'expression régionalisée de certains transgènes exprimés dans le muscle cardiaque nous a fourni un outil intéressant pour suivre différents sous-domaines du myocarde aussi bien in vivo pendant le développement du coeur normal que in vitro. Ainsi avec les explants du tube cardiaque précoce nous avons pu définir une fenêtre du temps pendant laquelle l'identité des oreillettes gauche/droite reste flexible tandis que le ventricule l'a déjà acquise. Le développement des vecteurs adénoviraux qui expriment différentes molécules de signalisation et de facteurs de régulation, nous permet de manipuler l'acquisition de cette identité sur l'axe gauche/droite ainsi éventuellement que celle du ventricule sur l'axe antérieur/postérieur.

Dans la plupart des cas les séquences régulatrices des transgènes sont responsables pour la régionalisation de leur transcription dans le coeur. Nous tentons de définir ces séquences par des expériences de transgenèse in vivo. Nous concluons, à la suite de manipulation in vitro des cardiomyocytes, que l'expression du transgène intégré dans le génome devient figée, probablement au niveau chromatinien, tôt pendant la cardiogenèse, vraisemblablement au moment où l'identité cellulaire est acquise dans le contexte du myocarde, tel que nous l'identifions dans les expériences avec les explants.

Une lignée transgénique particulière a été très informative sur la contribution inattendue de cellules, provenant du mésoderme antérieur, au myocarde du pôle artériel du coeur. Ce phénomène est confirmé par le suivi de ces cellules, marquées par injection de DiI, dans les embryons en culture. L'origine de cette partie du coeur est restée longtemps obscure. Il est clair maintenant, à la suite de nos observations chez l'embryon de la souris et des travaux récents d'autres laboratoires chez le poulet, qu'il existe une deuxième source de cellules précurseurs du coeur. Les cellules sont situées d'abord médiales au croissant cardiaque où se trouvent les premiers cardiomyocytes puis, suivant les mouvements des masses cellulaires qui accompagnent le développement de cette région, antérieures au tube cardiaque qui s'est formé par fusion du croissant et qui s'accroît par l'addition de cellules postérieurement. Les cellules provenant du champ cardiaque antérieur, que nous avons mises en évidence, s'ajoutent à la partie antérieure du tube cardiaque pour former la voie efférente du coeur et même, éventuellement, une partie du ventricule droit. Les expériences avec d'une part les explants provenant de la lignée dont l'expression du transgène marque cette région, et d'autre part les explants d'autres lignées transgéniques qui marquent différentes régions du myocarde, permettent de confirmer et d'étudier le phénomène.

Contrairement aux autres lignées transgéniques avec une expression régionalisée dans le coeur, l'expression du transgène dans le champ cardiaque antérieur est due au site d'intégration dans cette lignée. Il s'agit vraisemblablement d'un effet de ''piège'' d'élément de régulation du gène Fgf10 qui se trouve à proximité du transgène et dont le patron de transcription est très semblable. Nous recherchons actuellement cet élément. La perdurance de b-galactosidase permet de suivre l'incorporation de cellules dans le myocarde. En présence d'un inhibiteur de signalisation par Fgf, ce processus est perturbé dans les embryons en culture et les troncations de la voie efférente sont observées, indiquant un rôle probable pour Fgf10 dans la migration/prolifération des précurseurs de cette partie du coeur. Un autre Fgf, Fgf8, est également exprimé dans le champ antérieur cardiaque et peut expliquer pourquoi les souris mutantes Fgf10-/- n'ont pas un phénotype cardiaque très prononcé ; un examen plus détaillé est en cours. Notre lignée transgénique provoque également un phénotype, caractérisé pour être un hypomorphe de Fgf10.

La question de l'origine des populations de cellules qui colonisent les différentes parties du cœur peut également être abordée par analyse clonale rétrospective. Dans ce but nous avons ciblé le gène de l'actine cardiaque avec un gène rapporteur nlaacZ. Un événement de recombinaison rare rend le gène fonctionnel, (nlacZ), avec marquage par la b-galactosidase des cellules qui expriment l'actine cardiaque. L'analyse des clones ainsi visualisés chez l'embryon démontre que le pool de cellules fondatrices est grand. Les résultats indiquent une régionalisation clonale entre ventricule droit et gauche qui pourrait refléter l'histoire différente de ces deux compartiments. La comparaison des clones dans le muscle squelettique, également analysé avec ce transgène, montre des différences intéressantes. Par exemple, une analyse pendant la période périnatale démontre un marquage occasionnel presque complet de muscle unique, suggérant une origine oligoclonale.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Myriam TAISNE (Institut Pasteur)

Philippe DAUBAS (CNRS)

Robert KELLY (INSERM)

Marguerite LEMONNIER (INSERM) – jusqu'en novembre 2001

Frédéric RELAIX (INSERM)

Shahragim TAJBAKHSH (Institut Pasteur) – jusqu'en septembre 2001, à partir de 10/01, responsable d'un groupe indépendant.

Ted CHANG (postdoc)

Lola BAJARD (étudiante en DEA) – depuis septembre 2001

Ralf SPÖRLE (postdoc)

Sigolène MEILHAC (étudiante en thèse)

Stéphane ZAFFRAN (postdoc)

Catherine BODIN (IP)

Dominique MICHEL (IP)

Jacqueline PERREAU (CNRS)

Didier ROCANCOURT (IP)


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