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  Responsable : Alain Jacquier (jacquier@pasteur.fr)


  resume

 

Nous étudions divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae (maturation, transport, dégradation). 1) Nous identifions la fonction de nouvelles protéines engagées dans la maturation des ARN (ribosomiques et messagers). Pour cela, nous validons et étendons le réseau d'interactions issu de la banque d'interactions double hybride du laboratoire par des approches biochimiques (purification de complexes) et génétiques (cribles de co-létalité par exemple). 2) Nous caractérisons un complexe pré-ribosomique impliqué dans la maturation de la grande sous-unité ribosomique.



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Nous nous sommes engagés dans un programme d'identifications de fonction de nouvelles protéines chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Notre approche est appliquée au métabolisme des ARN. Ces voies métaboliques regroupent de nombreuses étapes qui vont de la transcription de ces molécules dans le noyau, jusqu'à leur dégradation dans le cytoplasme en passant par les étapes de maturation comme l'épissage, le clivage et la polyadénylation, l'addition de la coiffe ainsi que le transport nucléocytoplasmique.

Nous utilisons différentes techniques génériques comme le double-hybride, les purifications biochimiques par affinité (TAP) et des cribles génétiques. Nous sélectionnons, dans la base de données d'interactions double-hybride, des candidats de fonction biochimique inconnue, ayant une valeur double-hybride forte et connectés de manière spécifique à une étape métabolique donnée. Afin de valider ou d'invalider le réseau d'interactions identifié par double-hybride, nous appliquons à nos candidats une purification biochimique par affinité (TAP). Nous utilisons également une approche génétique de cribles de colétalité afin d'identifier des liens génétiques avec nos candidats choisis.

La combinaison de ces trois approches génériques nous permet de cerner l'étape dans laquelle sont impliqués nos candidats. Nous faisons alors une analyse classique de ces candidats en réalisant des tests fonctionnels spécifiques de l'étape identifiée afin d'affiner leur caractérisation.

- Composants de la petite sous-unité ribosomale mithochondriale

La protéine Ykl155c est reliée en double hybride à de nombreuses protéines, ce qui pourrait faire supposer que ces interactions sont non spécifiques. Toutefois, sa connexion à la fois à des facteurs d'épissage et à des facteurs de transport faisait d'elle un candidat attrayant. En fait, le complexe associé à Ykl155c s'est révélé correspondre à la petite sous-unité ribosomale mitochondriale. Ceci nous a conduit à identifier 12 nouvelles protéines de cette sous-unité ribosomale (Saveanu et al. (2001) J. Biol. Chem., 276, 15861-15867). Nous avons vérifié que ces nouveaux facteurs étaient effectivement localisés dans la mitochondrie et qu'ils étaient nécessaires à la fonction de celle-ci. Ce travail montre les limites du double hybride. Nous avons en effet sélectionné ici des interactions artéfactuelles. Ce sujet, bien que mené avec succès, n'est pas poursuivi car il est trop éloigné de la thématique générale du laboratoire.

- Yel015wp et la dégradation des ARNmessagers

Le réseau d'interactions double-hybride construit autour des huit protéines Lsm révèle un lien très fort entre la protéine Yel015w et le réseau de protéines impliquées dans la dégradation des ARN messagers (Fromont-Racine et al. (2000) Yeast, 17, 95-110). Les résultats de cribles de coléthalité, de purification par affinité ainsi qu'une analyse par micro-arrays sont en cours d'exploitation pour essayer de définir la fonction de Yel015wp.

Rôle d'une protéine intranucléaire du nucléopore

La protéine Yar002w a été choisie car elle était extrêmement connectée à un réseau d'interaction faisant intervenir de nombreuses protéines impliquées dans le transport. La purification du complexe biochimique qui lui est associé a confirmé en partie les résultats double-hybride. Il a été montré, par ailleurs, que Nup60p était une nucléoporine (Rout et al. J Cell Biol, 148, 635-651). Des liens double hybride, ainsi que des liens génétiques que nous avons identifiés suggèrent un rôle de cette protéine dans l'export des ARN. Cependant, l'ensemble des résultats indique que cette protéine a une fonction plus pléïotropique, à un carrefour des voies de transport, en interagissant avec des protéines du nucléoplasme.

- Nup60 et architecture nucléocytoplasmique

Le réseau d'interaction double-hybride centré autour de Nup60p a montré un lien avec la protéine Mlp2p qui, tout comme Mlp1p, est une protéine entrant dans la composition des filaments nucléaires. Ces filaments partent du pore nucléaire et participent à l'architecture nucléoplasmique. En collaboration avec le laboratoire de Ulf Nehrbass, nous avons montré que la protéine Nup60p est essentielle à la localisation de Mlp1p et Mlp2p, protéines requises pour la localisation des télomères à la périphérie du noyau. En l'absence de Nup60p, les télomères sont délocalisés et l'on aboutit à une perte de l'effet " silencing ". Ceci a fourni un modèle pour étudier le rôle de Mlp1p et Mlp2p dans l'organisation structurale et fonctionnelle de la chromatine périnucléaire (Feuerbach et al., Nature Cell Biology in press)

- Architecture nucléoplasmique et épissage

Vincent Gali dans le groupe de Ulf Nehrbass, à l'Institut Pasteur, avait mis en évidence un lien génétique entre Mlp1p et Prp18p, une protéine impliquée dans l'épissage. Nous avons montré que Mlp1p est impliquée dans la rétention des premessagers avec intron, sans pour autant que le défaut de Mlp1p n'affecte directement l'épissage. Ce travail se poursuit actuellement en collaboration avec Olivier Gadal et Ulf Nehrbass (manuscript en préparation).

- Caractérisation d'un complexe nucléaire pré-ribosomique

La protéine Ynr053c, que nous avons appelée Nog2p (Nucleolar-G-Protein 2), est nucléaire/nucléolaire. Elle est l'homologue chez la levure de la protéine humaine Ngp-1. La purification biochimique par affinité du complexe qui lui est associé a révélé qu'elle est associée à une sous-unité pré-60S nucléaire. Ce complexe est par ailleurs constitué, en plus d'un sous-ensemble de protéines ribosomales, de deux nouveaux facteurs, Nog1p et Rlp24p. Nous avons montré que Nog2p est essentielle pour les dernières étapes de la biogénèse de la grande sous-unité ribosomique 60S. Nog2p et Nog1p possèdent un domaine putatif de fixation du GTP et pourraient être impliquées dans la coordination des étapes de maturation et d'export de la grand sous-unité ribosomale (Saveanu et al. (2001) Embo J., 20, 1-11).



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LABOUISE Odile, labouise@pasteur.fr

FROMONT-RACINE, Micheline, CNRS CR1, mfromont@pasteur.fr

LEGRAIN, Pierre, CNRS DR1, plegrain@pasteur.fr, en disponibilité

SAVEANU Cosmin, Postdoc, csaveanu@pasteur.fr

BREARD, Gwenaël, Stagiaire en thèse, gbreard@pasteur.fr

CLERTE, Caroline, Postdoc, cclerte@pasteur.fr

COST, Grégory, Postdoc

HANTRAYE, Florence, Ingénieur de recherche, fricard@pasteur.fr

DECOURTY, Florence, Technicienne supérieure de laboratoire, decourty@pasteur.fr


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