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  Responsable : GICQUEL Brigitte (bgicquel@pasteur.fr)


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Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique: elle est responsable d'environ trois millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d'une efficacité relative. Quant à l'utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l'apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l'Unité de Génétique Mycobactérienne s'intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de M. tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l'identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie susceptibles d'entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d'une souche atténuée plus efficace que le BCG. L'unité étudie également la possibilité d'utiliser des souches de BCG portant des gènes étrangers pour protéger contre d'autres maladies, telles que le SIDA.



  rapport

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Etude génétique des déterminants de virulence(M. Jackson, O. Neyrolles, B. Gicquel)

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide de M. fortuitum pAL5000 et contenant le marqueur de contresélection sacB, a permis de construire et d'isoler des mutants d'échange allélique et de transposition chez les mycobactéries du complexe de M. tuberculosis (vecteur Ts/sacB). Ce vecteur a permis de rechercher des échanges alléliques conduisant à l'inactivation d'un certain nombre de gènes choisis pour leur similarité avec des gènes caractérisés chez d'autres pathogènes et connus pour jouer un rôle dans la virulence ou le maintien intracellulaire. Récemment, en collaboration avec l'équipe de Carlos Martin (Faculté de Médecine de Saragosse, Espagne), nous avons ainsi isolé un mutant possédant le gène codant pour le régulateur putatif phoP inactivé par insertion. Ce gène proche du gène putatif phoR, est essentiel à la multiplication de M. tuberculosis dans des macrophages de souris en culture in vitro et chez la souris principalement au niveau du poumon et de façon moindre au niveau de la rate et du foie. Ce couple de gènes phoP/phoR possède des similarités avec le système à deux composants phoP/phoQ, un régulateur de plusieurs déterminants de la virulence de Salmonella. Chez la souche M. bovis multirésistante aux antibiotiques et responsable d'une épidémie en Espagne, la séquence d'insertion IS6110 est trouvée en amont de phoP à quelques paires de bases, suggérant une régulation différente de ce gène chez cet isolat clinique et qui pourrait conduire à une souche plus virulente donc plus transmissible, contrairement à la plupart des souches de M. tuberculosis multirésistantes aux antibiotiques.

Grâce à l'outil Ts/sacB, une première banque de 7000 mutants de transposition de M. tuberculosis a été ordonnée et utilisée pour rechercher par PCR des mutations dans des gènes définis. Une seconde banque de 4000 souches a été obtenue en utilisant un transposon marqué. Celle-ci a permis d'utiliser la méthode STM ("Signature-tagged Transposon Mutagenesis") pour rechercher directement chez la souris des souches atténuées pour la virulence. Environ 2000 souches ont été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris. Seize mutants atténués ont été sélectionnés et les mutations qu'ils contiennent caractérisées. Quatre des insertions différentes sont localisées dans un groupe de 13 gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport d'un lipide de la capsule de M. tuberculosis : le dimycocérosate de phtiocerol. Le rôle de ce lipide dans la pathogénèse est en cours d'étude plus approfondie au laboratoire. Nous nous intéressons également à d'autres mutants isolés par la technique STM et qui présentent des déficiences dans la synthèse d'autres composés lipidiques de l'enveloppe mycobactérienne. Des nouvelles techniques de criblages de ces banques de mutants de transposition par STM ont été mises au point qui devraient permettre d'isoler de nouvelles souches atténuées du bacille de la tuberculose. L'intérêt vaccinal des souches atténuées de M. tuberculosis sont étudiées dans le contexte du "TB vaccine cluster" de la commission Européenne coordonné par Brigitte Gicquel: http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/.

Caractérisation fonctionnelle de facteurs de virulence (Jean-Marc Reyrat)

L'utilisation de la phosphatase alcaline comme gène rapporteur, de méthodes génétiques telle que la mutagénèse insertionnelle étiquetée, ou bien encore de l'outil informatique ont permis d'identifier un certain nombre de gènes de virulence. Plusieurs loci de virulence sont actuellement à l'étude dont Rv1395 un activateur de transcription de la famille AraC/XylS et Erp (Rv3810) une protéine secrétée par M. tuberculosis.

Erp est une protéine secrétee par les bactéries du complexe tuberculosis identifiée grâce à la méthodologie de la phosphatase alcaline. Chez M. tuberculosis, l'inactivation du gène erp par échange allélique a conduit à une atténuation majeure de la virulence aussi bien in vitro, en utilisant des cellules macrophagiques en culture, qu'in vivo dans le modèle murin de la tuberculose. Nous avons récemment montré que Erp est une protéine ubiquitaire des mycobactéries. Cette protéine secrétée est constituée de trois domaines. Le domaine central consiste en une répétition en tandem du motif PGLTS. Cette région centrale est le domaine le plus variable entre espèces : de 4 répétitions dans le cas de M. leprae et jusqu'à 24 pour M. xenopi (Figure 1) Une analyse de la région génomique encadrant le gène erp montre que celui-ci se situe dans une région comprenant principalement des gènes de biosynthèse de la paroi. Nous analysons à l'heure actuelle le rôle de Erp dans la structuration de la paroi mycobactérienne et le rôle éventuel du nombre de répétitions PGLTS dans la virulence de M. tuberculosis.

Un autre aspect du projet concerne la sécrétion chez les mycobactéries. En effet, un certain nombre de facteurs de virulence ou d'antigène sont présents à la surface du bacille ou bien dans le milieu extra-cellulaire. En utilisant la nucléase de Staphylococcus aureus en tant que gène rapporteur, nous avons montré que cette protéine est sécrétée dans le milieu extracellulaire indépendamment de la présence d'une signal-séquence. Des marqueurs cytoplasmiques ont montré que ce phénomène était indépendant de l'autolyse bactérienne. Ces résultats suggèrent l'existence d'une voie de secrétion indépéndante de la voie générale qui reste a être caractérisé.

 

BCG et nouveaux vaccins (Nathalie Winter)

Mycobactérium bovis BCG, vaccin vivant atténué, confère un certain niveau de protection contre la tuberculose et la lèpre. Sa capacité à persister dans les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles telles que le macrophage (MP) ou la cellule dendritique (CD), en font un immunogène attractif pour le développement de vaccins efficaces à long terme. Grâce au développement d'outils génétiques, notamment dans notre laboratoire, il est possible d'introduire des gènes hétérologues dans le BCG et de construire des souches de BCG recombinantes (rBCG). Dans le but d'obtenir des candidats vaccins contre le SIDA, nous avons construit de nombreuses souches de rBCG exprimant des antigènes du virus de l'immunodéficience simienne VISmac251. Le macaque cynomolgus infecté par VISmac251 développe une pathologie proche du SIDA humain et permet d'étudier des stratégies vaccinales contre le VIH.

Trois souches de rBCG exprimant le gène nef impliqué dans la régulation du cycle viral et les gènes structuraux gag (p26) et env de VISmac251 ont été obtenues. Le mélange équidose de ces trois souches (vaccin rBCG-SIV3) a été inoculé à des groupes de macaques cynomolgus par voie intradermique, la voie classique d'administration du BCG chez l'homme. L'infection virale étant principalement contractée par voie muqueuse, il est important d'induire une réponse immunitaire locale. Une dose rappel de rBCG-SIV3 a donc été administrée aux animaux par voie orale ou rectale. Les réponses immunitaires cellulaires induites ont été testées dans les cellules mononuclées du sang périphérique (CMSP). Une réponse de type lymphocyte T cytotoxique dirigée contre les antigènes Gag et Env a été détectée chez la plupart des animaux vaccinés par le mélange rBCG. Cette lyse s'est accompagnée d'une production d'IFNg, indiquant qu'une réponse de type Th1/Tc1 est induite. Une production d'IFNg fortement augmentée a été observée après le rappel muqueux de rBCG-SIV par la même voie. L'épreuve par le virus VISmac251 a été administrée par voie rectale et le virus a été détecté dans les CMSP de tous les animaux. Cependant, un animal sur les quatre ayant reçu le rappel rBCG-SIV3 par voie rectale a contrôlé complètement la charge virale indiquant que des souches de rBCG sont capables d'induire un certain degré de protection contre une épreuve virulente par VISmac251. Après l'inoculation du virus d'épreuve, des réponses humorales et lymphoProlifératives spécifiques des antigènes de VISmac251 plus fortes chez les animaux inoculés par rBCG-SIV3 que chez les groupes contrôles ont été observées. Ceci indique que la vaccination rBCG-SIV3 induit une réponse mémoire. Nous avons également observé que les souches utilisées portant les antigènes sur des vecteurs réplicatifs étaient instables in vivo. Ces études ont été effectuées en collaboration avec les équipes de R. Legrand (CEA, Fontenay-aux-Roses) et de A. Venet (Faculté de Médecine Paris Sud).

Parallèlement à cette première étude, de nouveaux vecteurs d'expression visant à améliorer la stabilité des souches de rBCG ont été développés. L'utilisation de vecteurs intégratifs a permis d'obtenir des souches de rBCG génétiquement parfaitement stables in vivo, dans le modèle murin. En corrélation avec l'expression forte et persistante des gènes hétérologues après immunisation par ces souches intégratives, des réponses immunitaires cellulaires et humorales de plus forte intensité et plus durables que celles observées après immunisation par des souches de rBCG portant des plasmides réplicatifs ont été observées  (Méderlé, I. et al. Infection and Immunity, Sous presse)

Le laboratoire s'intéresse également aux mécanismes d'induction de la réponse immunitaire après administration du vaccin BCG. Dans ce contexte, il parait important d'étudier l'intéraction entre BCG et cellules dendritiques (CD), les seules cellules présentatrices d'antigène professionnelles capables d'activer les lymphocytes T naïfs. Plusieurs travaux ont été entrepris sur ce sujet, notamment in vitro après mise au point de la technique d'obtention de cellules dendritiques à partir de précurseurs de moëlle osseuse murine. En collaboration avec Eric Prina et Jean-Claude Antoine (Unité d'Immuno Physiologie et Parasitisme Intracellulaire) la caractérisation de la vacuole de phagocytose du BCG dans la CD a été entreprise afin de mieux appréhender les mécanismes de présentation des antigènes mycobactériens aux lymphocytes T dans les temps précoces. En collaboration avec l'équipe de Claude Leclerc (Unité de Biologie des Régulations Immunitaires, IP), nous avons également observé que les CD jouaient un rôle prépondérant in vivo, dans la phase très précoce d'initiation de la réponse immunitaire anti-mycobactérienne et étaient notamment responsables de la synthèse d'IL12, une ctyokine-clé dans l'induction des réponses de type Th1 (Jiao,X. et al., Journal of Immunology, Sous presse)

ENSEIGNEMENT

L'Unité est un laboratoire d'accueil du "Marie Curie Host Fellowship" de la Commission Européenne. "Unravellling Mycobacterium pathogenicity. MCFH-1999-00615". http://www.cordis.lu/improving/

RÉSEAUX INTERNATIONAUX

L'unité fait partie des réseaux suivants de la commission européenne :

  1. "A cluster for tuberculosis vaccine development" (N° QLK2-CT-1999-01093). http://www.pasteur.fr/EC_TBvaccine/
  2. " Mucosal Immunization — Cluster Project ", (N° QLK2-CT-1999-00228).
  3. " New generation genetic markers and techniques for the epidemiology and control of tuberculosis " (N° QLK2-CT-2000-00630).
  4. " New strategies for treatment and prevention of mycobacterial diseases " (N° QLK2-CT-2000-01761).
  5. " Development of recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant parasitic and epizootic disease of ruminants in Latin America ", (N° ICA4-CT-2000-30032 (INCO-DEV).
  6. "Improved diagnosis, drug resistance detection and control of tuberculosis in Latin America".Projet (N°: ICA4-2000-10054).
  7. "Structural and functional genomics of M. tuberculosis", (N° QLRT-2000-02018).


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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

SINNO Helena, secrétaire de direction IP, hsinno@pasteur.fr

GICQUEL Brigitte, Professeur I.P., bgicquel@pasteur.fr

REYRAT Jean-Marc, CR 1, INSERM, jmreyrat@pasteur.fr

WINTER Nathalie, CR 2 IP, nwinter@pasteur.fr

CAMACHO Luis Reinaldo,, étudiant en thèse

EBRAHIMI RAD Mina, stagiaire post-doctorant

FERNANDEZ BOECHAT Neio, MD, étudiant en thèse

FILLACHET Fabrice, étudiant en DEA

FILLON-JACKSON Mary, boursière Roux I.P.

GHAEM-MAGHAMI, stagiaire postdoctorale

KORDULAKOVA Jana, étudiante en thèse

MARTINEZ Valérie, MD, étudiante en thèse

MEDERLE-MANGEOT Isabelle, étudiante en thèse

RECCHI Chiara, étudiante en thèse

ROUSSEAU Cécile, étudiante en thèse

SONDEN Berit, stagiaire postdoctorale

SUPPLY Philip, stagiaire post-doctoral

AUBERT-PIVERT Elisabeth, ingénieur IP, epivert@pasteur.fr

BADELL-OCANDO Edgar, ingénieur I.P., ebadell@pasteur.fr

BARNAY-VERDIER Stéphanie, ingénieur CDD, sverdier@pasteur.fr

BORDAT Yann, technicien supérieur I.P., ybordat@pasteur.fr

CHARLES Patricia, agent technique d'exploitation I.P.

ENSERGUEIX Danielle, technicienne supérieure I.P, densergu@pasteur.fr

RAUZIER Jean, technicien supérieur I.P., jrauzier@pasteur.fr


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