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  Responsable : ROUGEON François (frougeon@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de notre laboratoire sont centrés autour de deux axes principaux : (i) l'analyse des mécanismes moléculaires conduisant à l'expression clonale des immunoglobulines dans les lymphocytes B ; (ii) l'analyse des mécanismes qui contrôlent au niveau transcriptionnel et post-traductionnel l'expression de la rénine et de polypeptides propres à la glande sous-maxillaire des rongeurs.



  rapport

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1. Régulation de la recombinaison V(D)J des gènes des immunoglobulines (Michele Goodhardt)

Le réarrangement des gènes des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines (Ig) a lieu de manière séquentielle au cours du développement des lymphocytes B. Afin d'identifier les éléments impliqués dans la régulation du réarrangement des gènes des Ig, nous avons établi au laboratoire des lignées de souris transgéniques portant des gènes de chaîne légère k non réarrangés. Ces expériences ont mis en évidence deux types d'éléments intervenant dans la régulation du réarrangement : (i) des séquences activatrices associées à l'enhancer intronique k qui induisent le réarrangement ; (ii) des séquences de type silencer situées dans la région intersegmentale Vk-Jk qui confèrent la spécificité du réarrangement, en restreignant la recombinaison des gènes k aux précurseurs des lymphocytes B. Nous avons également montré que l'initiation et l'arrêt de la recombinaison V(D)J aux loci Ig endogènes sont précédés par une réorganisation de la structure chromatinienne : repositionnement des nucléosomes et modification de l'état d'acétylation des histones, de la sensibilité aux nucléases et de l'état de méthylation de l'ADN. Ces modifications semblent jouer un rôle critique dans la régulation de l'accessibilité des gènes des Ig à la machinerie de recombinaison.

2. Régulation de l'expression de la terminale transférase au cours du développement : rôle de la diversité dans la réponse immune (Noëlle Doyen)

La terminale transférase (TdT) est une enzyme impliquée dans la génération de la diversité des récepteurs aux antigènes (Igs et TCRs). Elle est en effet responsable de l'addition " aléatoire " de nucléotides (régions N), aux jonctions formées au cours de la recombinaison entre les segments géniques V(D)J. La TdT est exprimée spécifiquement dans les précurseurs lymphocytaires T et B et différentiellement au cours du développement, puisqu'elle n'apparaît que dans la semaine qui suit la naissance. Nous avons poursuivi l'étude des mécanismes responsables de l'expression différentielle de la TdT et montré que la régulation transcriptionnelle du gène de la TdT ne repose pas seulement sur des facteurs agissant en trans, mais sur des facteurs épigénétiques, comme des changements dans l'état de méthylation du gène. Nous avons entrepris de caractériser les différentes régions régulatrices du gène et nous étudions les changements dans la structure chromatinienne impliqués dans sa régulation.

L'expression différentielle de la TdT au cours du développement est à l'origine d'un répertoire peu diversifié chez l'embryon et plus complexe chez l'adulte. Afin de préciser le rôle de la régulation temporelle de la diversité N dans les récepteurs dans la réponse immune, nous étudions la réponse à différents pathogènes (notamment Shigella flexneri) dans deux modèles de souris transgéniques : l'un dans lequel nous avons élargi le spectre d'expression de la TdT au stade foetal et au cours de l'ontogénèse des cellules B et T et l'autre dans lequel le gène de la TdT a été invalidé.

3. Analyse in vitro des protéines partenaires de la recombinaison V(D)J (Catherine Papanicolaou)

Grâce à notre méthode de production de protéines hétérologues chez E.coli (DB/MD-99/112), nous avons obtenu les deux isoformes de TdT murine, une TdT délétée du tiers N-terminal et néanmoins active (TdTdelta130), les protéines RAG1 et RAG2 entières, ainsi que les protéines HMG1 et HMG2 : (i) nous avons comparé les deux TdT murines et montré que dans l'isoforme longue, la présence d'une insertion de vingt acides aminés dans une région très conservée modifie la susceptibilité à la chaleur, mais pas l'activité catalytique ; (ii) nous avons montré que la TdT, contrairement à toutes les autres polymérases, ne discrimine pas à l'étape d'incorporation entre ribonucléotides et déoxyribonucléotides, mais qu'elle accommode mal un substrat acide nucléique terminé par des ribonucléotides ; (iii) nous avons, en collaboration avec Marc Delarue (Unité d'Immunologie Structurale), obtenu des cristaux de la TdTdelta130 et la structure a été résolue. Seule et en complexe binaire avec un ADN simple-brin ou un nucléotide, la TdT ressemble à l'ADN polymérase beta (pol beta), ce qui renforce l'hypothèse d'une origine évolutive commune. La TdT adopte dans ces conditions une conformation fermée, telle que celle prise par pol beta, quand elle interagit avec ses deux substrats simultanément. La présence d'une boucle supplémentaire en lasso dans la TdT pourrait expliquer la différence de spécificité pour l'acide nucléique (simple versus double-brin) entre les deux polymérases ; (iv) nous avons étendu, à la lumière des données tridimensionnelles, notre analyse de variants de la TdT obtenus par mutagénèse, afin d'étudier ses mécanismes de sélection pour les substrats ADN simple brin et nucléotides ; (v) nous avons poursuivi la mise en place d'un système de recombinaison acellulaire avec des protéines non tronquées.

4. Caractérisation moléculaire et fonctionnelle d'un nouveau médiateur peptidique : la sialorphine (Catherine Rougeot)

Un ARNm majoritaire de la glande sous-maxillaire (GSM) du rat mâle adulte a été caractérisé dans le laboratoire. Il code pour un nouveau précurseur hormonal, nommé SMR1 (SubMandibular Rat1 protein), dont la synthèse dans la GSM et la prostate de rat est soumise à une régulation positive exercée par les androgènes.

Dans une approche de post-génomique intégrative, nous avons établi les bases moléculaires et fonctionnelles témoignant de l'existence chez le rat d'un système de régulation remarquable, qui implique un messager hormonal de signalisation extracellulaire, i.e., le peptide issu de l'ultime étape de maturation du précurseur SMR1 : le SMR1-Pentapeptide, nommé aujourd'hui sialorphine. En effet, l'ensemble des données accumulées depuis 1992, ont révélé que la sialorphine est impliquée dans la coordination tonique et dynamique des composants de la réponse comportementale adaptative de l'organisme à une agression. Ainsi, d'une part, ce signal spécifique de communication exocrine et endocrine est mobilisé, in vivo sous contrôle neuroendocrinien (androgène, adrénaline) et plus particulièrement dans les situations d'urgence (stress environnemental). Et d'autre part, nous avons montré que la sialorphine circulante est un antagoniste physiologique de l'activité d'une métallo-ectopeptidase membranaire, qui catalyse l'inactivation des hormones et neuropeptides contrôlant les réponses cardiovasculaire et inflammatoire, la réponse nociceptive et les échanges homéostatiques du phosphate et du sodium.

5. Régulation et évolution du gène codant le précurseur SMR1 (I. Rosinski-Chupin)



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BOUTOUT Laurence, IP, lboutout@pasteur.fr

ROSINSKI-CHUPIN Isabelle, IP, Chargé de Recherche, E-mail : ichupin@pasteur.fr (départ le 31/12/01)

DOYEN Noëlle, IP, Chef de Laboratoire, E-mail : ndoyen@pasteur.fr

GOODHARDT Michèle, CNRS, Chargé de Recherche 1, E-mail : migood@pasteur.fr

LEFEVERE-LAOIDE Brid, IP, Chargé de Recherche (départ fin Août 2001)

PAPANICOLAOU Catherine, CNRS, Chargé de Recherche 1, E-mail : papanico@pasteur.fr

RICCHETTI Miria, IP, Chargé de Recherche, E-mail : mricch@pasteur.fr (arrivée le 01/10/01)

ROUGEON François, CNRS/IP, DR1 CNRS, Professeur à l'Institut Pasteur, Chef d’Unité, E-mail : frougeon@pasteur.fr

ROUGEOT Catherine, IP, Chargé de Recherche, E-mail : crougeot@pasteur.fr

BOULE Jean-Baptiste, Thèse, E-mail : jbboule@pasteur.fr

CHERRIER Marie, Thèse, E-mail : cherrier@pasteur.fr

COQUILLEAU Isabelle, Thèse, E-mail : icoq@pasteur.fr (Thèse soutenue le 09/07/01 - départ le 31/07/01)

HUAULME Jean-François, Thèse, E-mail : jhuaulme@pasteur.fr

MAES Jérôme, Thèse, E-mail : jmaes@pasteur.fr (Thèse soutenue le 18/12/01)

BONNEFOY Géraldine, IP, Technicienne (arrivée le 27/11/01)

CAVELIER Patricia, CNRS, Technicienne, E-mail : cavelier@pasteur.fr

HERMITTE Véronique, IP, Technicienne, E-mail : hermitte@pasteur.fr (arrivée le 02/10/01)

KLIMCZAK Martine, IP, Technicienne, E-mail : mfanton@pasteur.fr

RIGAULT Anne-Gaëlle, IP, Technicienne, E-mail : arigault@pasteur.fr (départ le 03/10/01)


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