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  Responsable : Philippe BRÛLET (pbrulet@pasteur.fr)


  resume

 

Le répertoire comportemental de l'animal nécessite l'établissement de connexions neuronales spécifiques au cours de l'embryogenèse. L'analyse de la spécification génétique et du fonctionnement des circuits neuronaux pendant l'embryogenèse est au centre de nos activités de recherche. Des outils génétiques sont développés pour une imagerie moléculaire qui permette de visualiser l'activité et la connectivité des circuits neuronaux pendant leur mise en place et leur fonctionnement dans des animaux transgéniques



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Analyse génétique de la connectivité des circuits neuronaux chez l'animal transgénique (S. Roux, C. Saint Cloment, T. Curie, J. Miana-Mena)

Nous avons construit des protéines hybrides entre des fragments non toxiques de la toxine tétanique (TTC) et un gène rapporteur, LacZ ou GFP. Les molécules hybrides conservent les propriétés de transport rétrograde et trans-synaptique de la toxine. L'injection intramusculaire de ces protéines hybrides permet aussi d'analyser les voies d'endocytose, de transport inter et intracellulaire à la jonction neuromusculaire in vivo. Dans le muscle, la protéine se concentre très rapidement à la jonction post-synaptique. Dans le motoneurone, la sonde est transportée à travers la cellule jusqu'aux dendrites puis dans les cellules nerveuses interconnectées. Dans les cellules nerveuses et musculaires, la dynamique du transport dépend donc très fortement de l'activité neurale pré-synaptique. Des animaux transgéniques ont été construits dans lesquels le gène rapporteur GFP-TTC est placé sous le contrôle de promoteurs spécifiques du système nerveux central. L'imagerie du réseau neuronal est obtenue par la détection de la protéine après son transport à travers des synapses actives au sein du réseau. D'autres lignées de souris utilisant la mutagenèse dirigée et le déclenchement conditionnel pour l'expression du gène rapporteur sont en construction pour l'étude des mécanismes génétiques sous-jacents à la mise en place des réseaux au cours du développement. L'imagerie par microscopie confocale à multiphotons permet de suivre le transport intracellulaire et trans-synaptique. Cette approche d'imagerie moléculaire permettra de mieux définir aussi la plasticité synaptique.

Imagerie du calcium dans les cellules nerveuses (V. Baubet)

Par analogie avec les mécanismes bioluminescents de la méduse Aequorea victoria, nous avons construit de nouvelles protéines bioluminescentes sensibles aux ions Ca2+ en fusionnant la GFP avec l'aequorine. Ces molécules peuvent être ciblées à des organelles intracellulaires ou fusionnées à des récepteurs spécifiques . Nous avons adressé le marqueur dans le compartiment pré-synaptique par sa fusion avec la synaptotagmine, protéine impliquée dans les processus d'exocytose des neurotransmetteurs. Le marqueur GFP-aequorine peut aussi être ciblé à des sous-populations de cellules nerveuses dans des expériences de transgenèse classiques ou "knock-in". Finalement, nous pourrons,grâce à la détection de ces signaux bioluminescents, visualiser des flux calciques simultanément dans un grand nombre de cellules permettant d'établir des corrélations spatiales entre les différentes informations calciques. Pour étudier les mécanismes d'apoptose qui surviennent naturellement lors de la mise en place des réseaux neuronaux moteurs et suivre la formation des connexions neuromusculaires, nous avons ciblé la protéine bioluminescente dans le locus Hoxc-8. Une imagerie est developpée afin de visualiser l'activité cellulaire lors de l'intégration des informations dans le compartiment dendritique.

Les mécanismes génétiques du développement du cerveau (R. Hashemi , S. Picaud)

Pour chacun des homéogènes Otx1 et Otx2, substitué par le LacZ, des lignées de souris mutantes ont été obtenues. La mutation Otx2-/- est létale. En effet, elle entraîne une forte perturbation de la gastrulation. Ainsi l'induction du neuroectoderme antérieur ne peut se réaliser et de ce fait, les segments qui devraient former le pro-encéphale et le mésencéphale sont éliminés par la mutation. Nous avons, grâce à la technique du SAGE, comparé le transcriptome des embryons sauvages au tout début de la gastrulation à E6.5 avec celui des embryons mutants Otx2-/-. Deux cents gènes activés, réprimés ou fortement modulés par Otx2 à ce stade embryonnaire ont été identifiés. La transcription du facteur secrété FGF-15 est indétectable dans les embryons mutants. Par contre, chez l'embryon normal au tout début de la gastrulation FGF-15 est transcrit suivant un gradient, le long de l'axe proximo-distal, dans les cellules de l'ectoderme. Plus tardivement, il est aussi transcrit dans plusieurs régions du cerveau en développement, notamment dans l'Isthme et dans la Zona Limitans Intrathalamicus - ZLI. Sa mutagenèse conditionnelle est entreprise. La mutation nulle Otx1, par contre, influence la neurogenèse tardive. Le développement du néo-cortex est affecté et l'affinement des projections axonales des cellules corticales sur leurs cibles sous-corticales est perturbé, suggérant qu'Otx1 est nécessaire à l'établissement de la connectivité normale. Cette structure qui évolue le plus rapidement chez les mammifères est donc modifiée par la mutation de l'homéogène Otx1. Ces souris Otx1-/- sont aussi des animaux modèles pour l'épilepsie.

Isolement de cellules souches à partir de cellules somatiques (H. Le Mouellic)

Au cours de ces dernières années, des animaux vivants ont été obtenus après transplantation de noyaux de cellules somatiques dans l'œuf. Cette technique a été couronnée de succès chez la souris, la chèvre, le mouton et les bovins et serait probablement applicable à l'homme. Des facteurs, encore non identifiés mais localisés dans le cytoplasme de l'œuf, permettent de réinitialiser le programme génétique du développement et reprogramment les gènes de façon coordonnée. Sachant que la reprogrammation génétique peut se faire, nous étudions la possibilité d'isoler directement des cellules souches à partir de cellules somatiques, par mutagenèse.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

DE GROOTE Dominique (IP – Secrétaire) : degroote@pasteur.fr

BRULET Philippe (CNRS/IP - Responsable Unité) : pbrulet@pasteur.fr

LE MOUELLIC Hervé (Inserm) : hervelm@pasteur.fr

BAUBET Valérie (Post-doc) : départ 31.12.01

CURIE Thomas (Thésard) : tcurie@pasteur.fr

HASHEMI Reza (Thésard) : rhashemi@pasteur.fr

MIANA MENA Javier (stagiaire) : jmiana@pasteur.fr

PICAUD Sandrine (CNRS - Assistant-Ingénieur) : spicaud@pasteur.fr

ROUX Sylvie (Post-doc) : sroux@pasteur.fr

SAINT CLOMENT Cécile (IP - Technicienne sup. lab) : ccloment@pasteur.fr

RUSSE Sophie (IP - Aide de Laboratoire) : srusse@pasteur.fr


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