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  Responsable : FREITAS Antonio (afreitas@pasteur.fr)


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Les principaux objectifs scientifiques de l'UBPL sont l'étude de :

  • L'homéostasie ces cellules B et T
  • Les dynamiques des populations lymphocytaires et les mécanismes de la survie lymphocytaire
  • Le rôle de la compétition lymphocytaire dans la sélection des lymphocytes et dans le contrôle des réponses immunes, particulièrement dans l'induction et le maintien de la mémoire immunitaire



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I. Homéostasie lymphocytaire

Cellules B (Fabien Agenes & Manuela Rosado)

Chez la souris adulte, le nombre de cellules B demeure constant malgré la production continue de nouvelles cellules dans la moelle osseuse (MO). Les mécanismes déterminant le nombre de lymphocytes dans la souris adulte sont mal compris. Nous avons utilisé des souris déficientes B, avec un arrêt développemental de la production cellulaire B du stade pro-B à celui pré-B de la différentiation cellulaire B, afin d'étudier la capacité qu'un nombre limité de précurseurs B normaux ont à peupler les compartiments périphériques B. Nous avons montré que le nombre de précurseurs B ne détermine pas le nombre physiologique de cellules B périphériques. Nous sommes arrivés à une conclusion identique après parabiose entre une souris normale et deux ou trois souris déficientes B. Ces résultats démontrent que le nombre de cellules périphériques B n'est pas déterminé par les taux de production de cellules B de MO, mais est limité à la périphérie. Nous avons aussi montré, dans les mêmes chimères, que le compartiment de cellules B activées sécrétrices d'IgM était contrôlé par les mécanismes homéostatiques autonomes, le nombre de cellules qu'il comprend étant régulé indépendamment de la taille du compartiment des cellules B matures. Ces résultats confortent le modèle d'un système immunitaire dans lequel la taille des différents compartiments B (pré-B, cellules B au repos et cellules B sécrétrices d'IgM) serait régulée de façon autonome.

Dans un système immunitaire où il y a un excès permanent de production cellulaire B et où le nombre total de cellules B est maintenu constant, chaque cellule B nouvellement produite peut uniquement s'établir par la mort des autres cellules. Le maintien des cellules B à la périphérie pourrait toutefois être modifié par l'arrivée permanente de migrants de MO nouvellement formés alors que le sort de ces derniers à la périphérie pourrait aussi être altéré par la présence ou l'absence de populations B résidentes. Nous avons examiné les influences mutuelles possibles entre les populations résidentes établies de cellules B périphériques et les migrants B nouvellement formés. Lorsque nous avons étudié le sort des cellules B matures de lymphe node (LN) injectées dans des hôtes immunodéficients incapables de produire des cellules B, nous avons trouvé qu'une partie de la population transférée de cellules B LN s'accroissait et persistait pendant de longues périodes de temps. En résumé, nos résultats montrent que les cellules B toujours présentes après 2 semaines de transfert dans des hôtes immunodéficients représentent une population B stable qui se maintient pendant longtemps par autorenouvellement, qui résiste au remplacement et qui peut modifier le sort des cellules B nouvellement formées.

L'ensemble de nos résultats suggèrent une organisation hiérarchique où la première priorité est le maintien de taux d'IgM sérique normaux afin d'assurer une première barrière naturelle de protection et le maintien d'une diversité de répertoire maximum dans le compartiment de cellules B au repos.

Cellules T (Afonso Almeida, Jose Borghans, Nicolas Legrand & Alix de la Coste)

Les mécanismes déterminant le nombre de lymphocytes T dans le système périphérique lymphoïde sont mal compris. Chez la souris jeune, il y a un "ensemencement" permanent de la périphérie par des migrants thymiques nouvellement formés. Le nombre de cellules T périphériques reste toutefois constant. Ceci implique que soit 1) les migrants sont rapidement perdus sans même coloniser la périphérie, soit 2) il y a un remplacement permanent des cellules périphériques par des migrants thymiques récents. Nous avons développé une nouvelle stratégie permettant une estimation quantitative de la contribution de la production et l'exportation de cellules T thymiques dans l'établissement et le maintien des compartiments périphériques T. Nos résultats ont fortement contribué à la compréhension des mécanismes du rétablissement des cellules T après transplantation de MO ou tri-thérapie pour les individus infectés par le VIH. Nous avons montré ici que bien que la taille des compartiments périphériques T naïfs et mémoire soit en grande partie régulée indépendamment de la production du thymus, la récupération complète des cellules T nécessite un thymus fonctionnel minimum et ne peut être assurée qu'avec un nombre minimal de précurseurs DN compétents. Dans ce cas, des essais pour reconstituer la fonction du thymus sont recommandés lorsque le compartiment T périphérique est fortement déplété. Nous avons montré aussi qu'une production insuffisante de cellules T matures dans le thymus provoque des nombres de cellules T périphériques déficients, la sélection préférentielle de cellules T dans le compartiment mémoire/activé et des répertoires oligoclonaux, c'est-à-dire une situation qui imite l'évolution du système immunitaire avec l'âge.

Nous avons aussi étudié les mécanismes contrôlant l'expansion des cellules CD45RBhighCD25-CD4+ et CD45RBlowCD25+CD4+ après transfert dans des hôtes CD3e-/- déficients en cellules T. Nous avons trouvé que lorsque les deux populations T étaient co-injectées, la présence de cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ limitait l'expansion des cellules T CD45RBhighCD25-CD4+. Lors d'expériences de transfert cellulaire séquentiel, nous avons trouvé que le transfert d'un nombre limité (5x104) de cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ stoppe la croissance d'une population en expansion de 5x106 cellules T CD45RBhighCD25-CD4+ résidentes. Ces résultats montrent que les effets suppressifs ont une application physiologique réelle et doivent être particulièrement efficaces dans les environnements locaux, particulièrement lorsque le nombre de cellules CD25+ surpasse celui des cellules T CD4 naïves en prolifération. En conclusion, ces études montrent le rôle évident des interactions cellulaires T dans le contrôle homéostatique de la taille du compartiment périphérique T CD4+. Les cellules T CD45RBlowCD25+CD4+ agissent en limitant l'accumulation de cellules naïves T CD45RBhighCD25-CD4+ en division, c'est-à-dire qu'elles contrôlent la différentiation des cellules naïves T CD4 dans le compartiment cellulaire activé.

II. Compétition lymphocytaire et survie

Dans un système immunitaire où de nouveaux lymphocytes sont produits continuellement en excès mais où leur nombre total est maintenu constant, les cellules nouvellement produites doivent rentrer en compétition avec d'autres cellules nouvellement produites ou résidentes afin de survivre. La compétition peut être définie comme "une interaction entre deux populations, dans laquelle pour chacune les taux de naissance sont diminués ou les taux de mortalité augmentés en présence d'une autre population". Il existe deux principaux critères reconnus comme preuve d'une compétition entre populations : 1. La présence de compétiteurs devrait altérer les dynamiques, c'est-à-dire la durée de vie d'une population. La question de savoir si la compétition survient entre les cellules B et T a été abordée en comparant le développement et le sort des populations BCR-Tg, TCR-Tg et non-Tg dans différentes lignées de chimères de MO. On a trouvé que : a) lorsqu'elles sont injectées seules, les populations Tg et non-Tg ont un comportement identique et produisent des compartiments périphériques de même taille. b) lorsque les cellules Tg et non-Tg sont mélangées dans le même hôte, elles s'accumulent au début au même taux. Toutefois, après avoir atteint des nombres stables, il y a sélection préférentielle des cellules non-Tg à la périphérie. Ces observations répondent au premier critère de compétition car elles montrent que la présence de populations non-Tg modifie le nombre de cellules Tg. Nous avons aussi trouvé lors de ces expériences que l'espérance de vie des cellules Tg B et Tg T variait en fonction de la présence et du type des autres cellules en compétition. Ces dernières découvertes répondent au deuxième critère principal nécessaire à la définition de compétition comme elles prouvent que la présence de compétiteurs altèrent la durée de vie d'une population. Dans un système immunitaire où le nombre total de cellules est limité, la survie lymphocytaire ne peut plus être un phénomène passif mais plutôt un processus actif continu où chaque lymphocyte doit rentrer en compétition avec les autres lymphocytes. On peut dire que les lymphocytes suivent la Red Queen Hypothesis "it takes all the running you can do to keep in the same place".

Cellules B (Emmanuelle Gaudin & Manuela Rosado)

Les répertoires lymphocytaires se développent dans les organes lymphoïdes primaires aux stades précoces du développement B et T par des épisodes de sélection positive et négative. Pour qu'il y ait sélection positive, il suffit qu'un lymphocyte du même clone rencontre son antigène spécifique. Quel que soit le mécanisme de sélection impliqué, il est évident que la dose d'antigène doit jouer un rôle clé dans l'établissement des répertoires B et T. Nous avons étudié les effets de quantités variables d'antigène du soi dans le développement cellulaire B. Nous avons étudié le développement de cellules B spécifiques HEL exprimant différents taux de récepteurs Ig dans des chimères de MO produisant différentes quantités d'antigène du soi néo HEL. Dans les chimères exprimant de fortes concentrations d'HEL, les cellules B sont délétées ou diminuées fonctionnement, indépendamment du nombre de récepteurs exprimés. Dans les chimères avec de faibles taux d'HEL, les cellules B exprimant des quantités normales de récepteurs spécifiques HEL échappent à la sélection négative, alors que les cellules B exprimant moins de récepteurs, avec une affinité apparemment diminuée, sont positivement sélectionnées. Dans ces souris, le nombre de cellules B est 20 fois plus élevé que dans des chimères contrôle HEL- et une partie de ces cellules est activée et sécrète des IgMs spécifiques HEL, ce qui forme des complexes immuns avec HEL en circulation. Ces résultats ont d'importantes implications sur la compréhension de l'exclusion allélique Ig et l'homéostasie cellulaire B. Ils suggèrent aussi que les IgMs "naturels" réactifs au soi résultent de la sélection et l'activation de cellules B de faible avidité.

Cellules T (Nicolas Legrand & Sylvie Garcia)

Nous avons étudié les conditions nécessaires à la survie et l'expansion in vivo de cellules T CD8- naïves et mémoire spécifiques de l'antigène. Pour étudier les interactions TCR nécessaires à la survie ou la division des cellules T CD8 naïves, nous avons comparé leur sort après transfert dans des hôtes irradiés ce qui différait dans l'expression de l'antigène HY et de classe I du CMH. Les cellules T naïves pouvaient survivre à l'état de repos dans des souris femelles déficientes CD8- : elles n'incorporaient pas le BrdU et le nombre récupéré était constant du premier jour et ce jusqu'à deux semaines après injection. L'expansion des cellules naïves nécessitait une stimulation avec l'antigène mâle car elles se divisaient uniquement après transfert dans des hôtes mâles déficients CD8. La survie des cellules T naïves demandait le bon élément de restriction du CMH. Chez les souris déficientes en H-2Db, ou n'exprimant pas de classe I (H2-Db-b2m-), les cellules naïves ne survivaient pas mais dépérissaient jusqu'à atteindre environ 3% de la cohorte injectée à une semaine, 1% à 13 jours et devenaient indétectables à 2 semaines. Cette diminution était en rapport avec l'absence d'interactions avec l'élément de restriction du CMH car des cellules naïves Tg restreintes H-2Db se maintenaient après transfert dans des souris déficientes H-2Kb exprimant H-2Db. Aussi, comme cela a été décrit pendant la sélection thymique positive, un état minimal d'activation cellulaire peut permettre la survie, en l'absence de division cellulaire. Nous avons ensuite étudié les interactions TCR nécessaires au maintien de la mémoire T CD8+. Lorsque les cellules Tg mémoire étaient stimulées après transfert dans des souris mâles CD8-, leur taux de division (>90% de cellules BrdU+) était plus élevé que celui des cellules naïves. A l'opposé des cellules naïves, les cellules mémoire transférées dans des hôtes femelles CD8+ se divisaient aussi de façon intense (70% BrdU+), survivaient et se divisaient dans des souris ne portant pas l'élément de restriction H-2Db (42% BrdU+). Chez les souris déficientes en classe I (souris H2-Db-b2m-), environ 30% des cellules mémoire incorporaient encore BrdU, indiquant ainsi une réponse à l'autocrine ou aux facteurs de croissance environnementale, ceci même en l'absence de stimulation cellulaire T. Cependant, cette réponse était insuffisante pour maintenir les cellules T mémoire; elles disparaissaient progressivement. Deux semaines après le transfert de cellules T, les cellules donneur dans des hôtes déficients de classe I (H2-Db-b2m-) étaient à peine détectables.

Modification du programme d'expression génique chez les lymphocytes T activés en présence de cyclosporine A (Paolo Truffa-Bachi, Laurent Mascarell, Jean Kanellopoulos, Rodolphe Auger & Véronique Cadet-Daniel)

La cyclosporine A (CSA) est couramment utilisée en clinique pour assurer la transplantation d'organes. Toutefois, cette molécule n'induit pas de tolérance vis-à-vis des antigènes du greffon et doit être administrée à vie. La prise prolongée de l'immunosuppresseur conduit à l'augmentation des complications néoplasiques liée à l'immunosuppression générale induite par la CSA. Toutefois, d'autres processus peuvent être invoqués comme l'induction sélective par la CSA de la transcription de gènes codants pour des proto-oncogènes ou encore pour des facteurs de croissance ou de différentiation pouvant agir sur différents types cellulaires. Nous avons réalisé des analyses protéomiques qui ont montré que le profil des protéines nouvellement synthétisées lors de l'activation des LT est profondément modifié par la CSA. En particulier, la CSA favorise la néo-synthèse de protéines (‰ 150) qui ne sont pas retrouvées chez les LT activés en absence de CSA. Le rôle de cette synthèse protéique induite par la CSA dans le processus d'induction des tumeurs requiert d'abord la caractérisation de ces protéines et ensuite l'étude de leur rôle. Nous avons déjà identifié deux gènes dont l'expression est augmentée d'un facteur 5 à 10 lors de l'activation des LT en présence de CSA. Ces deux gènes, dont le rôle n ‘est pas encore connu, ont une expression tissu spécifique : les ARNm messagers correspondants sont retrouvés seulement dans la rate, les ganglions, le cerveau, le rein et la vessie. Des constructions permettant l'expression de ces gènes ont été réalisées et l'effet de leur transfection dans des lignées de lymphocytes T de souris devra permettre de définir un rôle éventuel dans les processus de tumorogénèse.



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VOUGNY, Marie-Christine (mcvougny@pasteur.fr)

FREITAS, Antonio, IP (Pr, afreitas@pasteur.fr)

GARCIA, Sylvie, IP (Assistante, sygarcia@pasteur.fr)

AGENES, Fabien, INSERM (CR2, fagenes@pasteur.fr)

DE LA COSTE, Alix, post-doct

BORGHANS, Josephina, post-doc

ALMEIDA, Afonso, étudiant thèse

GAUDIN, Emmanuelle, étudiante thèse

LEGRAND, Nicolas, étudiant thèse

MASCARELL, Laurent, étudiant thèse

SANCHEZ GUAJARDO, Vanesa, étudiante thèse

MAILHE-LEMBEZAT, Marie-Pierre (tech Sup Labo, mpmailhe@pasteur.fr)

CADET-DANIEL, Véronique (Tech Sup Labo, vcadet@pasteur.fr)

AUGER, Rodolphe (Ingénieur CNRS)

VOUGNY, Marie-Christine (Sec. Direction, mcvougny@pasteur.fr)


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