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  Cholvib


  Responsable : FOURNIER Jean-Michel (fournier@pasteur.fr)


  resume

 

La contribution de l'unité à la lutte contre le choléra se fait selon 4 thèmes : (1) le diagnostic bactériologique et l'épidémiologie moléculaire du choléra; (2) la mise au point d'un vaccin anticholérique glycoconjugué chimiquement défini; (3) l'identification bactériologique des vibrions non cholériques; (4) l'étude moléculaire des vibrions non cholériques d'intérêt médical. En raison de son expertise dans ces domaines, notre laboratoire est désigné " Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra " par le Ministère de la Santé.



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Les vibrions sont des bactéries à Gram négatif qui colonisent l'environnement marin. On distingue les "vibrions cholériques", incluant les isolats appartenant aux sérogroupes O1 et O139 de l'espèce Vibrio cholerae, et les "vibrions non cholériques", incluant les isolats appartenant aux sérogoupes autres que O1 et O139 de V. cholerae - appelés V. cholerae non-O1/non-O139 - et les isolats appartenant aux autres espèces du genre Vibrio. Nos objectifs sont de mieux comprendre comment les vibrions cholériques se propagent dans les pays atteints par des épidémies de choléra, de mettre au point un nouveau vaccin contre le choléra, et d'améliorer les méthodes moléculaires d'étude des vibrions cholériques et non cholériques isolés de l'environnement et des produits de la mer, afin de mieux évaluer les risques qu'ils représentent.

1. Diagnostic bactériologique et épidémiologie moléculaire du choléra (Marie-Laure QUILICI, Jean-Michel FOURNIER)

Le choléra reste aujourd'hui une maladie grave à la fois pour les individus et pour les collectivités. Selon l'OMS, à la suite de la dégradation des conditions socio-économiques survenue ces dernières années dans de nombreuses régions du monde, le nombre de personnes exposées à cette maladie a augmenté de façon spectaculaire, créant les conditions d'un problème majeur à l'échelle de la planète. Pendant l'année 2000, 56 pays ont officiellement déclaré à l'OMS un total de 137 071 cas de choléra ayant entraîné 4 908 décès. Cependant, selon l'OMS, les chiffres réels sont probablement plus élevés en raison de sous-déclarations et d'insuffisances des systèmes de surveillance.

Comme la plupart des pays développés qui bénéficient d'un niveau d'hygiène élevé, la France n'est pas directement concernée par des épidémies de choléra. Cependant des cas de choléra importés sont régulièrement diagnostiqués chez des voyageurs. Ces cas font l'objet d'une déclaration aux autorités nationales de santé (DGS, InVS) et à l'OMS. En 2001, 8 cas de choléra ont été recensés dans l'île de Mayotte, territoire français de l'Océan Indien. Ces cas sont survenus pour la plupart chez des personnes qui n'avaient pas été vaccinées lors de la campagne de vaccination effectuée en 2000. Deux cas de choléra sont survenus en France métropolitaine, le premier importé d'Indonésie, le second, du Togo. Ces dix cas n'ont entraîné aucun décès.

Les épidémies de choléra ne connaissent pas les frontières. C'est pourquoi nous collaborons avec des biologistes de pays concernés, avec les instituts du Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés, ainsi qu'avec des organisations humanitaires. En 2001, nous avons étudié 73 isolats de V. cholerae O1 reçus de 11 pays étrangers. Ces collaborations nous ont permis de faire des études d'épidémiologie moléculaire sur des souches de vibrions cholériques susceptibles d'être importées en France. Nous avons utilisé deux méthodes de typage moléculaire, le ribotypage et l'électrophorèse en champ pulsé, pour étudier la propagation des souches de Vibrio cholerae O1 responsables d'épidémies de choléra sur le continent africain depuis l'arrivée de la 7ème pandémie cholérique. A ce jour, 347 souches isolées dans 34 pays ont été étudiées. L'analyse des résultats est en cours.

2. Nouveau vaccin contre le choléra (Alain BOUTONNIER, Bruno DASSY, Jean-Michel FOURNIER)

La maîtrise à long-terme du choléra repose sur l'amélioration de l'hygiène par la fourniture d'eau potable, l'assainissement des effluents, et l'éducation sanitaire. Cependant, ces mesures sont coûteuses et il est difficile de faire évoluer les comportements des populations vis à vis de l'hygiène et de l'utilisation de l'eau. C'est pourquoi il est urgent de pouvoir disposer d'un vaccin anticholérique efficace à long terme chez tous les groupes d'âge, et en particulier chez les enfants de moins de 5 ans.

Le point de départ de notre recherche, qui a débuté en 1991, était de déterminer quels anticorps protègent contre le choléra. Nous avons démontré que des immunoglobulines G (IgG) monoclonales, dirigées contre la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide (LPS) de V. cholerae O1, sont protectrices dans un modèle d'infection expérimentale du souriceau nouveau-né. Nous avons aussi montré que des IgG, injectées par voie intraveineuse chez des souris adultes, passent dans la lumière intestinale. Ces résultats nous ont encouragés à commencer, en 1995, le développement de vaccins anticholériques chimiquement définis induisant des anticorps protecteurs IgG dirigés contre le polysaccharide du LPS de V. cholerae O1 et V. cholerae O139. Ces vaccins seront des glycoconjugués constitués de polysaccharides couplés par une liaison covalente à une protéine porteuse.

Le sérogroupe O1 de V. cholerae comprend deux sérotypes, Ogawa et Inaba. Le LPS du sérotype Ogawa contient un déterminant antigénique spécifique. Un autre déterminant antigénique est commun aux deux sérotypes, Ogawa et Inaba. Les LPS des deux sérotypes ont été purifiés et leurs déterminants antigéniques caractérisés par des méthodes immuno- et physico-chimiques. En étudiant, par cristallographie, la fixation d'un anticorps monoclonal anti-Ogawa à des oligosaccharides synthétiques mimant le polysaccharide Ogawa, nous avons montré que le monosaccharide terminal, portant un groupement 2-O-méthyl, est responsable de la spécificité Ogawa. Nous avons ensuite montré que le core et le polysaccharide spécifique du LPS sont tous les deux impliqués dans l'expression du déterminant antigénique commun aux sérotypes Ogawa et Inaba. Ces résultats vont nous aider à préparer sur des bases rationnelles des glycoconjugués contenant ces polysaccharides.

Le polysaccharide du LPS de V. cholerae O139 a été purifié puis conjugué à l'anatoxine tétanique. L'immunogénicité du glycoconjugué a été étudiée chez la souris. Le polysaccharide non conjugué induit essentiellement des immunoglobulines M, alors que des taux très faibles d'IgG anti-LPS sont détectés. Le glycoconjugué induit des taux élevés d'IgG, qui atteignent un maximum 3 mois après la première immunisation puis diminuent lentement pendant les 5 mois suivants. La conjugaison a donc amélioré l'immunogénicité du polysaccharide O139, en le transformant en antigène thymodépendant. L'évaluation clinique de ce glycoconjugué est prévue.

3. Identification bactériologique des vibrions non cholériques (Marie-Laure QUILICI, Jean-Michel FOURNIER)

Le genre Vibrio comprend plus de 50 espèces parmi lesquelles 7 espèces sont fréquemment isolées chez l'homme : V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hollisae, et V. mimicus. Ces vibrions non cholériques sont à l'origine de gastro-entérites, d'infections de la peau et des tissus mous et de septicémies, et de diverses infections extra-intestinales comme des otites. Les patients ayant une pathologie sous-jacente immunosuppressive sont exposés à une dissémination rapide de l'infection causée par ces germes. Dans la majorité des cas, ces infections sont associées à un contact direct avec l'eau de mer ou à la consommation de produits de la mer, leur apparition étant corrélée aux mois chauds de l'année.

En 2001, 11 cas d'infections à vibrions non cholériques ont été identifiés par le Centre National de Référence. Quatre cas de septicémies ou de gastro-entérites été dus à V. cholerae non-O1/non-O139, quatre cas de septicémies ou d'otites été dus à V. alginolyticus, 2 cas de septicémie et de gastro-entérites été dus à V. fluvialis et un cas d'infection des tissus mous et de septicémie a été causé par V. vulnificus. Onze isolats cliniques en provenance de Roumanie ainsi que quarante sept souches isolées de l'environnement ont aussi été étudiés.

4. Etude moléculaire des vibrions non cholériques (Annick ROBERT-PILLOT, Marie-Laure QUILICI)

Les modifications écologiques de l'environnement marin, consécutives à un changement climatique global ou à des activités industrielles locales, favorisent la prolifération et la dissémination des vibrions, qui peuvent coloniser l'homme, soit par contact direct avec l'eau de mer, soit après consommation de produits de la mer. De plus, l'augmentation du commerce international et de la consommation des produits de la mer à l'état cru, ainsi que l'accroissement du nombre de personnes immunodéprimées, laissent craindre une augmentation des infections dues aux vibrions non cholériques. Dans un souci de santé publique, il importe que soient développées des méthodes moléculaires permettant de détecter, identifier, et mettre en évidence les facteurs de virulence de deux espèces de vibrions, V. cholerae et V. parahaemolyticus, présentes dans l'eau de mer et dans les produits qui en sont issus.

C'est dans ce contexte que nous avons développé une méthode rapide et efficace pour la détection de V. cholerae dans l'eau de mer, par hybridation sur colonies. La sonde utilisée est une séquence de 22 nucléotides de la région intergénique de l'ARN 16S-23S. Nos efforts ont aussi porté sur l'identification d'isolats de V. parahaemolyticus provenant de l'environnement. Après avoir montré que les caractères biochimiques n'étaient pas assez précis pour faire la distinction entre cette espèce et V. alginolyticus, espèce très proche, nous avons montré qu'une réaction d'amplification génique (PCR), utilisant une séquence R72H spécifique de V. parahaemolyticus, représente un outil fiable pour l'identification de cette espèce.

Les souches environnementales de V. cholerae constituent un réservoir de gènes de virulence et, à ce titre, peuvent représenter un danger pour les populations. Nous surveillons par typage moléculaire l'évolution d'isolats environnementaux par comparaison avec des isolats d'origine humaine. A ce jour, 86 isolats humains et 185 isolats environnementaux ont été caractérisés par ribotypie.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BREGEAT Annick, abregeat@pasteur.fr

DASSY Bruno, Maître de Conférences, Université Paris VI, bdassy@pasteur.fr

FOURNIER Jean-Michel, Chef de Laboratoire IP, fournier@pasteur.fr

QUILICI Marie-Laure, Chargée de Recherche IP, quilici@pasteur.fr

ROBERT-PILLOT Annick, arp@pasteur.fr

MASIP Montserrat

DENIS Loïc

ROBERT Quentin

BOUTONNIER Alain, Ingénieur IP, abouto@pasteur.fr

GUENOLE, Alain,Technicien IP, aguenole@pasteur.fr

OUZILLEAU Betty, Technicienne IP

En commun avec le Laboratoire des Listeria :

BERTEL Arnaud, Aide de Laboratoire IP

DELAIRE Marie-Claire, Agent de laboratoire IP

TESSAUD Nathalie, Aide de Laboratoire IP


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