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  Responsable : Huynh-Dinh Tam (hdt@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de l'Unité de Chimie Organique concernent la synthèse et l'étude de trois classes importantes de composés biologiques : nucléosides ou nucléotides, peptides et sucres. L'accès à ces molécules permet de déterminer leurs structures et leurs interactions, en vue de la mise au point de vaccins synthétiques ou d'inhibiteurs d'enzymes, en collaboration avec d'autres unités pasteuriennes. Deux groupes de l'Unité ont développé un programme de sélection in vivo et d'évolution dirigée in vitro d'enzymes.



  rapport

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Polyosides bactériens et développement de vaccins synthétiques chimiquement définis (L.Mulard).

Le rôle clé des polyosides de surface bactérienne comme cibles majeures de la réponse immunitaire protectrice de l'hôte en réponse à une infection est maintenant bien établi. Fondé sur la notion d'épitopes osidiques "protecteurs" et dérivé du concept de l'haptène, le développement d'immunogènes synthétiques offre une alternative aux vaccins conjugués "polyosides:protéines" conventionnels. Inscrit dans cette thématique, notre but est de développer des constructions chimiquement définies, présentant de façon multivalente une combinaison d'épitopes osidiques "protecteurs" (épitopes B) et d'épitopes T appropriés à l'induction d'une réponse mémoire. Shigella flexneri, responsable d'une forme sévère de dysenterie, est utilisée comme modèle pour démontrer le potentiel de l'approche glycoconjugués synthétiques dans le domaine des vaccins multivalents.

L'approche en cours d'étude implique une bonne connaissance de la spécificité de la réponse immunitaire de l'hôte en réponse à l'infection. Dans ce but, une panoplie d'oligosides complexes, représentatifs de fragments des polyosides de surface de S. flexneri sérotypes 2a et 5a, ont été synthétisés. L'étude de leur interaction avec des anticorps monoclonaux protecteurs a permis de caractériser les éléments clés de la reconnaisance. Sélectionnés sur la base de cette approche rationnelle, des fragments courts du polyoside de surface de S. flexneri 2a ont été synthétisés sous une forme permettant leur conjugaison et donc l'accès à des glycoconjugués à potentiel vaccinal.

Epitopes glycosylés secrétés par Mycobacterium tuberculosis (L. Mulard, F. Baleux).

Des données récentes suggèrent que certaines protéines mannosylées sécrétées par la bactérie sont des antigènes immunodominants lors des infections par M. tuberculosis. Des épitopes majeurs de nature glycopeptidique leurs seraient associés. L'approche biochimique a permis de proposer les séquences en acides aminés associées à plusieurs de ces cibles potentielles, sans toutefois révéler leurs glycoformes. Mettant à profit la flexibilité de la synthèse peptidique sur phase solide et celle de la glycochimie, une panoplie de peptides diversement mannosylés ont été synthétisés. Leur évaluation comme épitopes potentiels de M. tuberculosis est en cours.

Synthèse d'analogues de nucléosides et nucléotides comme antiviraux potentiels (L. Mulard).

Les nucléosides a-boranophosphate apparaissent comme de bons candidats pour le développement d'antiviraux actifs contre les souches résistantes de HIV. Nous avons entrepris, sur le modèle d4T, de synthétiser différents modèles de prodrogues susceptibles de pallier au problème du passage transmembranaire de ces analogues chargés.

Par ailleurs, divers analogues de la Ribavirine et les nucléotides correspondants ont été synthétisés dans le but de développer de nouveaux antiviraux actifs contre le virus de la Dengue.

Synthèse peptidique (F. Baleux)

Chimiokines/HIV

L'entrée du virus HIV dans les cellules via CD4 et les co-récepteurs CXCR4/CCR5 peut être bloquée par les ligands naturels de ces co-récepteurs :les chimiokines SDF-1a et Mip-1b/RANTES. Ces protéines de 70 AAs sont accessibles à la synthèse chimique qui permet de plus d'introduire sélectivement des marqueurs (fluorochromes, biotine) sur des AAs qui ne participent pas à l'activité biologique des chimiokines, générant ainsi des protéines entièrement fonctionnelles.

Outre l'importance de l'interaction SDF/HS, nous avons mis en évidence deux sérines protéases responsables de coupures de SDF sur sa partie N-terminale. Ces chimiokines tronquées sont dépourvues d'activité biologique. La modification chimique des liaisons peptidiques cibles de ces enzymes nous ont permis de générer des protéines résistantes à la dégradation par ces deux sérines protéases.

Structure, repliement de peptides et interaction avec les membranes

PMP1 est une petite protéine membranaire de Saccharomyces Cerevisiae régulant l'activité de l'H+ ATPase. Malgré son caractère très hydrophobe, nous avons réalisé la synthèse de PMP1 qui a été choisie comme modèle pour explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans l'interaction lipides/peptides. L'analyse de la propension structurale intrinsèque des hélices de la PrP en corrélation avec la formation d'agrégats amyloïdes a été entreprise en introduisant des mutations au sein de ces hélices.

Synthèse et réactivité biologique de nucléosides hétérodoxes (A. Kaminski, S. Pochet)

Notre activité de recherche vise à élargir la gamme des acides nucléiques qui peuvent être répliquées in vitro ou in vivo. Nous avons développé un procédé combinatoire de synthèse permettant d'engendrer une vaste collection de nucléosides triphosphate pour les soumettre à des tests d'incorporation par des ADN polymérases et cribler des monomères doués de capacité d'appariement univoque ou ambiguë et/ou des inhibiteurs de réplication. Parallèlement à l'altération de la partie hétérocyclique du nucléoside, une deuxième modification concernant le squelette phosphopentose a été abordée. Nous avons montré que des mimes d'acides nucléiques où l'ose est constitué d'un cycle à six atomes (Hexitol Nucleic Acid) sont reconnus par les ADN polymérases et peuvent transférer l'information génétique in vivo.

Par ailleurs, afin d'accéder à une plus grande diversité d'analogues nucléosidiques déviant par la base ou par le sucre, nous avons isolé des gènes codant pour une activité N-désoxyribosyltransférase de différentes souches de lactobacilles. Disposant d'une variété d'enzymes, nous pourrons élargir leur spécificité par des mutations dans les gènes sauvages ou par des chimères de ces gènes sauvages. Le premier criblage de mutants nous a permis de sélectionner in vivo dans une souche d'E. coli auxotrophe pour l'uracile une N-didésoxyribosyltransférase.

D'autre part, un programme visant à proposer des molécules inhibitrices des monophosphate kinases TMPK, UMPK et STMPK qui sont essentielles à la croissance de M. tuberculosis vient de débuter (en collaboration avec le laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules). L'approche retenue est la conception rationnelle de drogues à partir de la structure tridimensionnelle des cibles, puis la synthèse et la détermination du pouvoir inhibiteur des différents composés synthétisés tout d'abord in vitro sur la protéine purifiée, puis in vivo sur des cultures de M. tuberculosis. La caractérisation biochimique de la thymidylate kinase (TMPK) de M. tuberculosis a mis en évidence des propriétés structurales et catalytiques nouvelles, faisant de cette protéine une bonne cible pour la recherche d'antituberculeux.

Oligonucléotides (T. Huynh-Dinh)

Nous avons particulièrement développé la synthèse ex-situ de puces à ADN en collaboration avec différents laboratoires extérieurs. L'objectif est d'obtenir des puces fiables, donnant des résultats reproductibles et d'un moindre coût. Deux méthodes de greffage par liaison covalente du 5' et 3' ont été développées, ainsi qu'une étude de la silanisation de la surface de lames de verre.

D'autres travaux ont porté sur la conformation d'oligonucléotides (boucles ARN, triple hélices), les interactions acides nucléiques-protéines (complexe de dimérization-nucléocapside) et la synthèse d'ARNi pour le contrôle de l'expression de gènes de HIV.

Glycopeptides synthétiques à potentiel vaccinal anti-tumoral (S. Bay)

S'appuyant sur une approche rationnelle et spécifique de l'immunothérapie anti-tumorale, notre programme de recherche vise à développer des vaccins synthétiques basés sur des marqueurs tumoraux saccharidiques. Nous avons ainsi mis au point un nouveau type d'immunogène : le MAG ou Multiple Antigenic Glycopeptide qui présente l'épitope saccharidique d'intérêt (i.e. le marqueur tumoral) de façon multivalente en association avec un épitope T CD4+ peptidique. Le caractère synthétique des MAG constitue un avantage de sécurité essentiel en vue de leur utilisation in vivo.

L'ensemble de nos résultats (collaboration avec R. Lo-Man et C. Leclerc, Institut Pasteur) montre que le MAG est une stratégie efficace pour générer des taux élevés d'anticorps spécifiques du marqueur saccharidique et prolonger la survie de souris porteuses de tumeur, après vaccination thérapeutique ou prophylactique.

Notre objectif est désormais de synthétiser une nouvelle génération de composés plus efficaces et utilisables chez l'homme, en introduisant des épitopes T CD4+ "universels" ainsi que des épitopes CTL humains au sein des structures. L'immunogénicité de premiers composés modèles linéaires est en cours d'évaluation chez des souris transgéniques pour les molécules HLA. Les glycopeptides sélectionnés seront ensuite assemblés sous forme de MAG par couplage de fragments.

Une autre partie de notre programme consiste à synthétiser des glycopeptides pour induire des réponses T cytotoxiques spécifiques, ainsi que pour étudier la spécificité de glycosyl transférases, d'anticorps, et de lectines.

Evolution dirigée d'enzymes (J.L. Jestin)

Dans le groupe d'évolution dirigée des enzymes, nous développons une Chimie des Inovirus pour sélectionner des protéines en fonction de leur activité catalytique. L'objectif consiste à élaborer une stratégie qui permette d'isoler des catalyseurs pour des réactions chimiques données par sélection in vitro.

La sélection in vitro en fonction de l'activité catalytique est une sélection en fonction de l'affinité pour le produit, qui est ponté à la phage-enzyme qui a catalysé la réaction de substrat à produit. Les enzymes sont exprimées à la surface de phages pour établir un lien entre le génotype, qui est amplifiable et qui caractérise la protéine, et le phénotype, c'est-à-dire l'activité catalytique recherchée.

Ainsi, il a été montré que des ADN-polymérases ADN-dépendantes peuvent être exprimées comme des enzymes actives à la surface de bactériophages filamenteux. Ces protéines de plus de 65 kDa sont faiblement exprimées à la surface des phages, 1 phage-polymérase pour 1000 phages, lorsque le système du phagemide est utilisé. Nous avons montré qu'un taux d'expression de 1 pour 5 pouvait être atteint en isolant des séquences signal à partir d'une banque de séquences signal bien choisie soumise à plusieurs cycles de sélection in vitro. Un consensus pour les séquences signal qui optimisent l'expression de ces protéines à la surface de phages a été défini.

Actuellement, nous visons à développer de nouvelles sélections en fonction de l'activité catalytique pour d'autres enzymes et à isoler des catalyseurs pour des réactions choisies à partir de banques de protéines synthétiques ou naturelles.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Garnier Marie-Ange, mag@pasteur.fr

Baleux Françoise, IP (CR, baleux@pasteur.fr)

Bay Sylvie, IP (Assistante, sbay@pasteur.fr)

Huynh-Dinh Tam, CNRS (DR1, hdt@pasteur.fr)

Jestin Jean-Luc, IP (Assistant, jjestin@pasteur.fr)

Kaminski Pierre-Alexandre, IP (CR, akaminsk@pasteur.fr)

Mulard Laurence, IP (CR, lmulard@pasteur.fr)

Pochet Sylvie, CNRS (CR1, spochet@pasteur.fr)

Vichier-Guerre Sophie, CNRS (CR2, svichier@pasteur.fr)

Bélot Frédéric, Post-doc

Bousserouel Hadjira, DEA

Cadena Amaro Claudio, Thèse

Cocoletzi Avila Brenda, DEA

Perrier Sandrine, Thèse

Strobel Heike, Post-doc

Coïc Yves-Marie, IP (Ingénieur, ymcoic@pasteur.fr)

Delafond Nathalie, IP (Agent de Laboratoire)

Dugué Laurence, IP (Technicienne Supérieure, ldugue@pasteur.fr)

Dutruel Olivier, IP (Technicien supérieur, odutruel@pasteur.fr)

Fantini Emmanuelle, IP (Technicienne Supérieure, efantini@pasteur.fr)

Gouyette Catherine, IP (Ingénieur, oligos@pasteur.fr)

Groh François, IP (Technicien supérieur, fgroh@pasteur.fr)

Guerreiro Catherine, IP (Technicienne Supérieure, cguerrei@pasteur.fr)

Helynck Olivier, IP (Technicien supérieur)

Huteau Valérie, IP (Technicienne Supérieure, vhuteau@pasteur.fr)

Raghouber Josiane, IP (Agent de Laboratoire)

Ughetto-Monfrin Joël, CNRS (Ingénieur, ughetto@pasteur.fr)

Vieira Da Silva Francisco, IP (Agent de Laboratoire)


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