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  Responsable : Pedro M. Alzari (alzari@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de recherche de l'Unité de Biochimie Structurale sont orientés vers l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Les thèmes centraux de recherche comprennent l'enzymologie structurale de microorganismes pathogènes (mycobactéries, trypanosomatides) et la reconnaissance moléculaire de sucres dans différents systèmes biologiques.



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Le cellulosome bactérien, reconnaissance moléculaire de sucres (B. G. Guimaraes, F. Schaeffer, H. Souchon, D. Tello, P.M. Alzari)

La bactérie thermophile anaérobie C. thermocellum synthétise un système enzymatique, le cellulosome, capable de dégrader la cellulose cristalline. Le cellulosome est composé de plusieurs sous-unités catalytiques (glycosidases) et non-catalytiques associées sous la forme d'un complexe muliti-protéique de haut poids moléculaire. En collaboration avec P. Béguin (IP), nous avons entamé depuis plusieurs années l'analyse structurale et fonctionnelle des sous-unités du complexe afin de comprendre les bases moléculaires de l'hydrolyse de polysaccharides et la spécificité des interactions protéine-protéine et protéine-sucre. Parmi nos travaux récents, nous avons réalisé une étude structurale et thermodynamique des interactions cohésine-dockérine (responsables de l'assemblage macromoléculaire du cellulosome), nous avons déterminé la structure tridimensionnelle de la cellobiohydrolase CelS, principale composante enzymatique du complexe, à 2.2 Å de résolution, et celle de l'endoglucanase CelA complexée au substrat à résolution atomique (0.94 Å). Ces résultats ont mis en évidence une distorsion importante de l'oligosaccharide dans le site actif, laquelle jouerait un rôle stabilisateur de l'état de transition réactionnel, et ont démontré que deux familles de glycosidases n'ayant aucune similarité de séquence (endoglucanases de la famille 8 et cellobiohydrolases de la famille 48) utilisent le même mécanisme catalytique pour hydrolyser les chaînes de cellulose.

D'autres études structurales de complexes protéine-sucre en cours au laboratoire incluent la reconnaissance moléculaire d'un marqueur tumoral, l'antigène Tn, par des anticorps et des lectines spécifiques (en collaboration avec E. Osinaga, Fac. de Médicine, Uruguay) et la reconnaissance immunitaire du lipopolysaccharide de V. cholerae (en collaboration avec J.M. Fournier, IP, P. Kovac, NIH, USA).

 

Trans-sialidases de trypanosomes (M.F. Amaya, A. Buschiazzo, T.N. Nguyen, P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei, l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. En collaboration avec l'équipe de A.C. Frasch (Université de San Martin, Argentine), nous avons entamé l'analyse structurale d'enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques. Nous avons d'abord déterminé la structure 3D de la sialidase de T. rangeli à 2.2 Å de résolution et démontré que ces enzymes sont constituées de deux domaines, un domaine " beta-propeller " catalytique et un domaine du type lectine. Des études de mutagenèse dirigée nous ont permis ensuite d'identifier des résidus importants pour l'activité de transglycosylation. Plus récemment, nous avons produit un mutant de surface de la trans-sialidase de T. cruzi pour faciliter la cristallisation et nous avons déterminé la structure 3D à 1.6 Å de résolution. L'analyse structurale comparative de ces deux enzymes permettra de mieux comprendre les bases moléculaires de l'activité de transfert et fournie une cible potentielle pour la conception de nouveaux antibiotiques.

 

Enzymes mycobactériennes impliquées dans la résistance aux antibiotiques (B.G. Guimaraes, H. Souchon, P.M. Alzari)

Protéines kinases et phosphatases mycobactériennes (B. Boitel, M. Ortiz, F. Pompeo, T. Nguyen, P.M. Alzari)

En s'appuyant sur les résultats génomiques, nos études visent à élucider la structure tridimensionnelle d'enzymes mycobactériennes étant (ou pouvant être) associées à la pathogénicité et à la virulence de M. tuberculosis, afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques. En collaboration avec les équipes de S.T. Cole et O. Barzu (IP), nos travaux portent sur deux enzymes impliquées dans les mécanismes de résistance aux antibiotiques (la catalase-peroxidase KatG et l'alkyl hydroperoxide réductase AhpC) et sur la famille de Sérine/Thréonine protéines kinases et protéines phosphatases impliquées dans la signalisation intracellulaire. Au cours de la dernière année, nous avons déterminé la structure tridimensionnelle d'AhpC à 2.2 Å de résolution, dont l'affinement cristallographique est en cours. Par ailleurs, l'ensemble de gènes codant pour les domaines catalytiques des protéines kinases et phosphatases dans le génome de M. tuberculosis ont été sous-clonés dans des vecteurs d'expression bactériens appropriés et, pour certains, les protéines recombinantes ont été obtenues sous forme soluble. La caractérisation biochimique et structurale des différentes protéines est en cours.

 

Le facteur inducteur d'apoptose AIF, représentant d'une nouvelle famille de flavoprotéines (M.J. Mate Perez, M. Ortiz, B. Boitel, D. Tello, P.M. Alzari)

La mitochondrie joue un rôle clé dans la régulation de l'apoptose ou mort cellulaire programmée. Les facteurs mitochondriaux impliqués dans ce processus incluent le cytochrome c, certaines procaspases et le facteur inducteur d'apoptose AIF. En collaboration avec l'équipe de G. Kroemer à Villejuif, ce dernier a été identifié comme étant une flavoprotéine homologue à une famille d'oxydoréductases bactériennes. La protéine AIF recombinante est capable d'induire la condensation de chromatine dans des noyaux isolés et la fragmentation à grande échelle de l'ADN, ainsi que la libération des protéines apoptogéniques à partir des mitochondries purifiées. L'objectif central de notre étude est de caractériser structuralement le facteur murin inducteur d'apoptose AIF et des enzymes mycobactériennes homologues, afin de comprendre les mécanismes catalytiques de cette nouvelle famille d'oxydoréductases et leur rôle dans l'initiation et la régulation de l'apoptose.

 

Biocalorimétrie et thermodynamique structurale (F. Schaeffer, P.M. Alzari)

Les travaux de recherche en biocalorimétrie ont pour but la description quantitative des forces qui gouvernent la formation des complexes biomoléculaires. Cette approche, avec l'analyse structurale des molécules étudiées, ouvre la voie à la conception de molécules affines basée sur les principes de la thermodynamique. Les méthodes sont la calorimétrie de titration isotherme, la calorimétrie à balayage des températures, avec le développement de la thermodynamique statistique des interactions moléculaires qui permet la déconvolution des énergies d'association en termes structuraux. Les thèmes abordés sont l'interaction protéine-ligand et protéine-ADN. Ils comprennent l'étude de l'interaction des protéines dockerin et cohesin à la base de la formation du cellulosome bactérien (collaboration avec P. Béguin, IP); l'interaction de protéines tyrosine-kinases et son application à la conception de nouveaux immunosuppresseurs (collaboration avec O. Acuto, IP); l'interaction de facteurs sanguin humains impliqués dans la coagulation et son application à la conception d'anti-coagulants (collaboration avec C. Bon, IP; C. Mounier, Université Cergy-Pontoise; M. Gelb, Université de Washington); l'interaction de facteurs de transcriptions et de l'ADN promoteur de gènes impliqués dans la cancérisation et l'invasion tumorale (collaboration avec M. Aumercier et D. Sthéhelin, IP de Lille).

 

Etude cristallographique de la terminal désoxynucléotidyltransférase (T. Vatzakis, N. Expert-Bezancon, M. Delarue).

La terminal transférase appartient à la famille des polymerases beta (ou pol X). Elle est capable d'élonger un "primer" (amorce) oligonucléotidique long d'au moins 3 bases, à partir des dNTP présents en solution, ajoutes aléatoirement puisque l'enzyme fonctionne sans matrice à recopier. On pense qu'elle est responsable in vivo de la génération d'une partie de la diversité du système immunitaire à travers l'élongation des régions N a la jonction V(D)J des gènes des immunoglubulines.

Le but de cette étude, en collaboration avec l'Unité de Biochimie et de Génétique du Développement, est de caractériser structuralement la spécificité relativement étendue de cette enzyme vis-à-vis de nucléotides triphosphates modifiés et le rôle des ions métalliques dans le site actif. Des cristaux diffractant à 2.4 angstrœms ont été obtenus et trois dérivés lourds ont été enregistrés, permettant ainsi le calcul d'une carte de densité électronique à 3.0 Angstrom de résolution. La carte a été interprétée et le modèle affiné avec un facteur d'accord de 21% (R-free 26%) à la résolution maximale des données. Les implications biologiques du modèle sont en cours d'analyse. Enfin, des cristaux de complexes binaires (TdT + oligonucléotide) et (TdT + ddNTP + Co++) ont été enregistrés et montrent de la densité électronique pour construire les différents substrats de l'enzyme dans le site actif. D'autres essais sont en cours avec les cations divalents Mn++ et Zn++.

 

Etude cristallographique des TMP kinases bactériennes (A. Haouz, M. Delarue)

La TMP kinase est une cible potentielle nouvelle pour le design d'antibiotiques. En collaboration avec le Laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules, nous avons cristallisé différentes TMP kinase bactériennes, dont celle de M. tuberculosis qui diffracte à 1.9 Angstrom de résolution et a été résolue par remplacement isomorphe. Son affinement est terminé et l'analyse de la structure en comparaison avec les autres structures de TMP Kinases bactériennes et d'eucaryotes a été effectuée et publiée cette année.

Nous nous attachons à l'étude cristallographique de différents complexes de cette protéine avec des inhibiteurs, ce qui nous permettra, à terme, d'affiner la synthèse d'antibiotiques potentiels. Parallèlement, les caractéristiques enzymologiques de ces inhibiteurs potentiels sont déterminées au laboratoire grâce à un dosage direct par HPLC de tous les substrats et produits de la réaction. Ce projet a bénéficié du soutien d'un programme européen.

 

Cristallisation de la protéine non-structurale NSP3 de rotavirus (N. Expert-Bezancon, M. Delarue)

La protéine NSP3 de rotavirus a été récemment caractérisée par le groupe de J. Cohen et D. Poncet à l'INRA (Jouy-en-Josas); elle est responsable de l'adressage des RNA messagers viraux sur la machinerie de transcription de la cellule hôte. Nous cherchons à cristalliser cette protéine complexée à l'ARN viral, afin de mieux comprendre la nature des interactions mises en jeu. Nous avons récemment réussi à produire de grandes quantités de protéine soluble à 2-3 mg/ml, puis à la concentrer encore plus à 10 mg/ml en présence d'un oligonucléotide RNA substrat. Des essais de cristallisation sont en cours.

 

Nouvelle méthode d'affinement et de combinaison des phases en cristallographie (M. Delarue)

En collaboration avec H. Orland (CEA), nous avons dérivé une nouvelle théorie de la combinaison de phase qui généralise tous les formalismes précédents. Des considérations thermodynamiques tres simples permettent d'estimer les poids relatifs des contraintes expérimentales et celles dérivées de la modification de densité. Diverses études numériques montrent que la méthode marche tres bien lors de l'affinement d'un modèle ainsi que lors de l'aplatissement du solvant.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

FEJT, Françoise (ffejt@pasteur.fr)

ALZARI, Pedro M. (Chef de laboratoire IP, alzari@pasteur.fr)

DELARUE, Marc (CR1 CNRS, delarue@pasteur.fr)

SCHAEFFER, Francis (Chargé de Recherche IP, fschaeff@pasteur.fr)

AMAYA, Maria Fernanda (Etudiante en thèse, amaya@pasteur.fr)

BOITEL, Brigitte (Post-Doc, bboitel@pasteur.fr)

BUSCHIAZZO, Alejandro (Post-Doc, alebus@pasteur.fr)

GOMES GUIMARAES, Beatriz (Post-Doc, beatriz@pasteur.fr)

HAOUZ, Ahmed (Post-Doc, ahouz@pasteur.fr)

MATE PEREZ, Maria Jesus (Post-Doc, mmate@pasteur.fr)

POMPEO, Frédérique (Post-Doc, fpompeo@pasteur.fr)

ORTIZ LOMBARDIA, Miguel (Post-Doc, ortiz@pasteur.fr)

VATZAKI, Efstratia (Post-Doc, vatzaki@pasteur.fr)

EXPERT-BESANCON, Nicole (Ingénieur IP, nexpert@pasteur.fr)

NGUYEN, Tong (Ingénieur IP, tong@pasteur.fr)

SOUCHON, Hélène (ITA CNRS, hsouchon@pasteur.fr)

TELLO, Diana (Ingénieur IP, dtello@pasteur.fr)


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