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  Responsable : Baranton Guy (gbaran@pasteur.fr)


  resume

 

La possibilité d'inactiver des gènes chez Leptospira ouvre la voie à l'étude de la fonction de ceux-ci. Chez Borrelia, l'observation que l'invasivité potentielle d'une souche lui soit conférée par un seul gène ouvre aussi un nouveau champ d'études. Chez les Yersinia, l'analyse de déterminants chromosomiques et leur comparaison chez les différentes espèces pathogènes a ouvert une nouvelle voie d'approche vers une meilleure compréhension des mécanismes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis.



  rapport

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Introduction

L'un des pôles de recherche de l'Unité est l'étude des spirochètes avec une direction fondamentale : approches génétiques, interaction des spirochètes avec leur hôte, et un domaine appliqué : taxonomie, phylogénie et diagnostic. L'autre groupe bactérien exploré est celui des Yersinia dont, là encore, la structure du génome et son degré de stabilité sont analysés. Des facteurs de virulence, dont les gènes sont regroupés en un îlot de haute pathogénicité particulièrement instable, sont étudiés. L'épidémiologie moléculaire est également un secteur d'intérêt pour les spirochètes comme pour les Yersinia.

SPIROCHETES

Les spirochètes, agents de leptospirose (une anthropozoonose), borréliose de Lyme (transmise par des tiques) et autres spirochétoses sont des bactéries pathogènes à croissance lente. Ces bactéries se prêtent enfin à l'analyse par la génétique classique. La démonstration de la diversité des souches américaines et européennes de Borrelia burgdorferi, alliée aux divers symptômes (dermatologiques, neurologiques et articulaires) a conduit à l'individualisation de nouvelles espèces

LEPTOSPIRES

Protéines liant la pénicilline chez les Leptospires. (A. Brenot, D. Trott, I.Saint Girons, R. Zuerner).

La plupart des bactéries possèdent des protéines qui fixent la pénicilline ("PBP") de manière covalente. Ces PBP sont ancrées dans la membrane cytoplasmique et participent aux étapes terminales de l'assemblée du peptidoglycane et donc à la maintenance de la morphologie cellulaire. Les betalactames agissent comme analogues de substrat pour la transpeptidation et se lient de manière covalente aux sites actifs des PBPs. Six PBPs ont été mises en évidence chez L. interrogans par un test fonctionnel. Les gènes ponA et pbpB ont été isolés. PonA et pbpB codent PBP1 et PBP3 respectivement. Les protéines PBP1 et PBP3 de L. interrogans sont synthétisées chez E. coli et modifiées avec l'ampicilline utilisant un conjugué digoxygénine-ampicilline. Ces données montrent que les deux gènes codent des protéines fonctionnelles fixant la pénicilline.

Un système de restriction-modification chez les leptospires. (Brenot, A. Werts, C., Ottone, C, Sertour, Charon, N., Postic, D., Baranton, G, and Saint Girons I.).

Grâce aux résultats de titration d'un leptobactériophage, nous avons pu mettre en évidence la présence d'un système de restriction-modification chez une souche de leptospire. Ces résultats indiquent l'importance de la connaissance de la présence d'enzymes de restriction et de modification pour le choix de la souche réceptrice lors d'essais de transfert génétique.

Génétique réverse pour les leptospires saprophytes: immobilité d'un mutant flaB. (M. Picardeau, A. Brenot, I. Saint Girons).

Un outil essentiel pour comprendre la biologie des bactéries est la capacité à inactiver n'importe quel gène à volonté. Le remplacement ciblé de gène est effectué en routine chez la plupart des bactéries mais n'était pas possible chez le genre Leptospira. La construction d'un vecteur navette L. biflexa-E. coli a résolu plusieurs questions. En particulier il a été montré qu'un marqueur de résistance à la kanamycine d'une bactérie Gram-positive est fonctionnel chez les leptospires saprophytes. Cependant l'échange allélique requiert une étape additionnelle de stimulation de la recombinaison homologue. Nous avons choisi flaB (codant la flagelline, constituant la partie centrale de l'endoflagelle) comme gène cible et un mutant flaB: kanR a été obtenu, peu mobile, de morphologie altérée et sans endoflagelle visible. Ces résultats démontrent que FlaB est impliqué dans l'assemblage des flagelles et dans la motilité des leptospires. Ils montrent également la faisabilité de la génétique reverse chez les leptospires saprophytes. Deux autres gènes recA et metY ont été inactivés, indiquant que la génétique réverse est actuellement un outil performant chez les leptospires. Des expériences sont en cours pour étendre ces résultats aux leptospires pathogènes.

Les leptospires à l'ère de la génomique: identification d'un locus toxine-antitoxine. M. Picardeau, Shuangxi Ren (Chine), I. Saint Girons).

La séquence génomique de Leptospira interrogans souche Lai est terminée, effectuée par le Centre National Chinois du Génome Humain à Shanghai. L'accès précoce à 100 kb de séquence nous a permis de montrer l'existence d'un locus toxine-antitoxine, homologue du locus pem/chp. Le rôle physiologique de ce locus toxine-antitoxine chromosomique que l'on trouve chez les bactéries Gram-positive, Gram-négative, les Archae et les spirochètes n'est pas clair. Il a été suggéré qu'il fasse partie d'une réponse à des stimuli environnementaux comme le stress nutritionnel.

Récepteurs "toll-like"(TLRS) et LPS des leptospires. (Werts C., R.I Tapping, J.C. Mathison, T-H Chuang, V. Kravchenko, I. Saint Girons, D. Haake, P.J.Godowski, F. Hayashi, A. Ozinsky, D. Underhill, C.J. Kirschning, H. Wagner, A. Aderem, P.S. Tobias, and R.J. Ulevitch).

Les pathogènes bactériens activent le système d'immunité innée de l'hôte via les récepteurs TLRs, qui reconnaissent des composants conservés des bactéries (lipopolysacharide, peptidoglycane, lipoprotéines, ADN). Nous avons montré que le LPS de Leptospira active les macrophages via le CD14 et le récepteur TLR2. TLR4, constituant le récepteur au LPS des bactéries à Gram-négatif, n'est pas impliqué dans la réponse au LPS de Leptospira. Ces données présentent une nouvelle base pour la compréhension de la réponse immunitaire innée pendant l'infection par Leptospira. Du fait de sa spécificité, le LPS de Leptospira constitue un outil de choix dans l'étude des réponses cellulaires initiées par les récepteurs TLRs.

Centre National de référence (CNR) et Centre Collaborateur OMS/FAO (CCOMS) des Leptospires. (E. Fournié, N. Sertour, E. Bellenger, P. Bourhy, A. Duvaquier, D. Postic, G. Baranton).

http://www.pasteur.fr/sante/

Le rapport annuel 2001 du CNR/CCOMS sera disponible vers la fin du 1er trimestre 2002 compte tenu du délai nécessaire au recueil et traitement des données transmises par nos correspondants privilégiés. Il pourra alors être consulté sur:

http://www.pasteur.fr/recherche/Leptospira/LeptospiraF.html

BORRELIA

Les Borrelia, en France comme aux USA ou en Asie sont notamment responsables de la maladie de Lyme. Des informations sur ce sujet peuvent être obtenues à:

http://www.pasteur.fr/recherche/borrelia/Welcome.html

Prédominance de Borrelia lusitaniae en Tunisie. (H. Younsi, D. Postic, G. Baranton).

A l'initiative de collègues tunisiens, une étude des Borrelia présentes chez les tiques Ixodes ricinus en Tunisie a été entreprise. Une prévalence élevée de l'infection (> 30% chez les nymphes et adultes) a été démontrée chez cette tique (n = 490). Cependant, tant par PCR (61 amplicons) que par culture (16 isolats), B. lusitaniae, espèce rarement retrouvée en Europe et dont la pathogénicité semble improbable, s'est révélée comme presque exclusive. Cependant, une des souches isolées a été identifiée comme B. garinii, espèce pathogène pour l'homme. Ceci est la 1ère confirmation bactériologique de l'existence de l'agent responsable de cette maladie sur le continent africain.

Modalités de transferts latéraux de petits fragments de séquences de Borrelia burgdorferi conduisant à un gène ospC mosaïque: hypothèse d'un "Gene Transfert Agent" (GTA). (D. E. Dykhuizen, G. Baranton).

En collaboration avec Dan Dykhuizen à Stony Brook, nous avons pu montrer que le gène ospC présente une exceptionnelle diversité liée à un mode évolutionnel rare: "diversifying selection" qui permet le développement d'un véritable répertoire de motifs antigéniques. Ce répertoire répond à la nécessité pour la bactérie d'échapper aux anticorps anti OspC protecteurs suscités par les hôtes potentiels. Compte tenu de l'absence dans le génome de Borrelia de gènes codant un système de restriction-modification, aucune des modalités habituelles de transferts génétiques chez les bactéries ne peut expliquer la constitution de ces gènes ospC mosaïques. Une hypothèse serait que certains plasmides de Borrelia correspondent à un "GTA" à savoir un phage dont la capside est si petite qu'elle ne peut accueillir de génome phagique mais seulement de petits fragments d'ADN bactérien: phage "altruiste".

La séquence du gène ospC permet de prédire chez l'homme l'évolution de la maladie de Lyme. (G. Theodore, D. Dykhuizen, D. Postic, G. Baranton).

Toujours en collaboration avec Dan Dykhuizen et son équipe, nous avons montré que toutes les souches isolées de formes dites invasives (généralisées et non seulement cutanées précoces) de cette maladie appartenaient à un petit nombre (une dizaine) de génotypes ospC. Si on considère l'ensemble des séquences ospC disponibles dans les banques, ces10 génotypes (sur une centaine) pour les 3 espèces pathogènes regroupent les 36 séquences de souches isolées de formes invasives sur 204 séquences ospC au total. 36 autres souches isolées de tiques ou de formes localisées qui se regroupent sur ces mêmes 10 génotypes représentent des souches potentiellement invasives. Les autres souches isolées de formes cutanées n'appartenant pas à ces 10 génotypes invasifs, auraient probablement disparu sans séquelles avec ou sans traitement. Quand à la majorité des souches isolées de tiques, nous émettons l'hypothèse que même appartenant aux "espèces pathogènes" elles sont non infectieuses pour l'homme.

LEGIONELLA ET FRANCISELLA

Legionella est un genre bactérien regroupant des espèces endémiques des milieux aquatiques naturels et surtout artificiels tels les circuits d'eaux et les tours de climatisation. L'importance de ces bactéries provient de ce que L. pneumophilia peut provoquer chez l'homme immunitairement fragilisé des pneumonies graves connues sous le nom de maladie des Légionnaires.

Francisella tularensis, agent d'une zoonose, est une très petite bactérie infectant les mammifères rongeurs ou Léporidés. C'est la seule bactérie capable de passer à travers la peau saine. Ceci en fait un agent potentiel de bioterrorisme ce d'autant que la sous espèce nord américaine: subsp. tularensis aurait chez l'homme un taux de létalité proche de 30%.

Laboratoire des Legionella et Francisella. (C. Tram).

- Legionella. 66 échantillons d'eaux ont été expertisés jusqu'à ce jour (30/11/2001). Les 66 souches correspondantes ont été identifiées par PCR (gène mip) et anticorps monoclonaux.

- Francisella tularensis subsp. holartica. En 2001, parmi les 6 souches humaines qui ont été identifiées et confirmées par PCR, 2 correspondent à d'exceptionnelles formes pulmonaires de tularémie. 83 sérums ont par ailleurs été soumis à westernblot et/ou PCR. Suite au stage de formation effectué dans l'unité, le Laboratoire de Bactériologie de Maison Alfort a pu lui-même appliquer nos techniques aux souches d'origine vétérinaire.

YERSINIA

Le genre Yersinia comprend 3 espèces pathogènes pour l'homme: les espèces entéropathogènes Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica, et l'agent de la peste, Y. pestis.

Les principaux axes de travail du laboratoire des Yersinia sont:

- la caractérisation d'un îlot de pathogénicité qui confère aux souches qui l'hébergent la capacité de provoquer des infections systémiques chez l'homme et l'animal.

- les bases moléculaires du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Pour cela, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis, bactérie "jumelle" mais de virulence bien moindre vient d'être achevé. Une analyse de génomique comparative est maintenant en cours et va être suivie d'une approche de transcriptomes comparés.

- les relations de Y. pestis avec son insecte vecteur, la puce.

- la physiopathologie de l'infection à Yersinia.

- l'évolution de Y. pestis depuis son apparition récente à partir de Y. pseudotuberculosis.

- la résistance aux antibiotiques et l'évaluation de nouveaux traitements.

- la santé publique (Centre National de Référence et Centre Collaborateur de l'OMS).

Les travaux ayant fait l'objet de publications en 2001 sont les suivants:

1. Caractérisation d'une souche clinique de Yersinia pestis portant une résistance de haut niveau à la streptomycine. (Guiyoule A., G. Gerbaud, C. Buchrieser, M. Galimand, L. Rahalison, S. Chanteau, P. Courvalin et E. Carniel).

Une souche de Y. pestis multirésistante aux antibiotiques avait précédemment été isolée d'un patient malgache. Une autre souche exprimant une résistance de haut niveau à la streptomycine (antibiotique de première intention pour le traitement de la peste) a été à nouveau identifiée récemment chez un patient malgache atteint de peste bubonique. L'analyse de cette nouvelle souche a montré qu'elle hébergeait un plasmide autotransférable de 40 kb. Ce plasmide fait partie de la famille R751 à large spectre d'hôtes et porte les gènes strA et strB qui confèrent un haut niveau de résistance à la streptomycine. Le transfert in vitro de ce plasmide à d'autres souches de Y. pestis est observée avec une fréquence très élevée. La souche comme le plasmide sont différents de ceux précédemment décrits. Nous assistons donc actuellement à l'émergence de souches de Y. pestis portant des résistances de type plasmidique aux antibiotiques.

2. Mécanismes responsables de la non-expression de l'uréase chez Y. pestis et effet de la réactivation de cette enzyme sur sa pathogénicité. (Sebanne F., A. Devalckenaere, J. Foulon, E. Carniel et M. Simonet).

Alors que les espèces Y. pestis et Y. pseudotuberculosis sont génétiquement quasi-identiques, elles possèdent un pouvoir pathogène très différent. Curieusement, de nombreux gènes présent chez les deux espèces sont fonctionnels chez Y. pseudotuberculosis et mutés chez Y. pestis. Ceci est notamment le cas de l'uréase. Le séquençage du locus ure de Y. pestis a montré qu'il différait de celui de Y. pseudotuberculosis essentiellement par la présence d'une guanine supplémentaire, introduisant un codon stop prématuré dans la séquence du gène ureD de Y. pestis. Chez des mutants uréase positifs spontanés de Y. pestis, le nucléotide additionnel est éliminé et une phase de lecture ouverte est restaurée. L'expression de l'uréase n'altère pas la pathogénicité de Y. pestis après injection par voie intraveineuse, sous-cutanée et intragastrique à la souris. De même, aucune différence significative de multiplication in vivo entre la souche parentale et le mutant isogénique Ure+ n'a été observée lors d'expériences de co-infection .

3. Identification et charactérisation d'un nouvel hémophore chez Yersinia pestis. (Rossi M. S., J. D. Fetherston, S. Létoffé, E. Carniel, R. D. Perry et J.-M. Ghigo).

HasA est une protéine identifiée originellement chez Serratia marcescens et plus récemment chez Pseudomonas aeruginosa. Cette protéine, une fois sécrétée, capture l'hème circulante et le complexe HasA-hème se fixe sur un récepteur membranaire (HasR), permettant ainsi l'internalisation des molécules de fer nécessaires au métabolisme bactérien. Un gène homologue à hasA est présent sur le chromosome de Y. pestis. Après clonage et surexpression de ce gène chez E. coli, une protéine reconnue par les anticorps anti-HasA est produite et sécrétée par le système de S. marcescens, ce qui suggère que le gène de Y. pestis est fonctionnel. Cependant, l'expression de hasA n'a pu être observée chez Y. pestis dans les conditions naturelles. Par contre, la protéine a été produite après introduction du gène chez Y. pestis sur un plasmide en multicopies. Une mutation dans hasA, seule ou en association avec une mutation dans l'autre système d'utilisation de l'hème (hmu), ne modifie pas la virulence de Y. pestis dans le modèle murin.

4. La réaction inflammatoire induite par des glycolipides de Yersinia pseudotuberculosis contient des cellules NKT. (Guinet F., C. Ronet, M. Mempel, M. Huerre, E. Carniel, and G. Gachelin).

Alors que l'exploration de l'immunité adaptatrice au cours des yersinioses a permis de mettre en évidence l'importance d'une réaction cellulaire de type Th1, les événements précoces de l'immunité cellulaire sont peu connus. Ceux-ci, pourtant, sont selon toute vraisemblance importants pour déterminer l'évolution différentielle sur les quelques heures/jours qui suivent une infection à Y. pestis ou Y. pseudotuberculosis. Afin d'étudier ce type de réponse au cours des infections à Yersinia, nous avons entrepris l'analyse de la réponse cellulaire générée in vivo, dans un modèle murin, après injection d'extraits hydrophobes de Y. pseudotuberculosis. Un infiltrat inflammatoire aigu avec abondance de lymphocytes T est observé dès 48h. La majorité des cellules recrutées sont des cellules T Valpha14. Les glycolipides de Y. pseudotuberculosis induisent donc une réponse inflammatoire comparable à celle de Mycobacterium tuberculosis malgré des composés de parois très différents.

5. Centre National de Référence des Yersinia et Centre Collaborateur de l'OMS. (L. Martin, F. Guinet, E. Carniel).

Voir le site web CNR des Yersinia (http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/yersinia-index.html)

6. Séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis. (V. Chenal, D. Dacheux, E. Carniel, E. Garcia, P. Chain).

Une analyse comparative des génomes de Y. pestis (récemment séquencé) et de Y. pseudotuberculosis (bactérie génétiquement très proche de Y. pestis mais de virulence bien moindre) pourrait aider à l'identification de gènes responsables du pouvoir pathogène exceptionnel de Y. pestis. Grâce à une collaboration entre le Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) aux États-Unis et notre laboratoire, le séquençage du génome de Y. pseudotuberculosis vient d'être achevé. La phase de génomique comparative est maintenant en cours.



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