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  Responsable : André KLIER (aklier@pasteur.fr)


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L'Unité de Biochimie Microbienne a poursuivi l'étude de la régulation de l'expression génétique chez les bactéries Gram-positives modèles (Bacillus, Streptomyces) et a élargi son domaine de recherche à l'étude des facteurs de virulence chez des bactéries Gram-positives pathogènes (Listeria, Streptocoques, Staphylocoques).



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Etude du régulon sigma 54 de Bacillus subtilis (M. Débarbouillé, J. Bignon, N. Ould Ali)

Le gène sigL de B. subtilis a été caractérisé dans l'Unité. Il code pour un facteur sigma de type sigma 54. Sigma L est requis pour l'utilisation d'aminoacides comme sources d'azote (arginine, ornithine, isoleucine et valine) et de source de carbone (fructose). La protéine RocR appartient à la famille NtrC/NifA, dont les membres se lient à des séquences de type enhancer, appelées UAS. RocR contrôle deux opérons : rocABC et rocDEF, impliqués dans la dégradation de l'arginine et l'ornithine en glutamate. Les deux opérons ont des promoteurs sigL dépendant et sont induits par l'arginine ou l'ornithine. Le gène rocG qui code pour une glutamate déshydrogénase, est localisé juste en amont de l'opéron rocABC. Sa transcription est elle aussi activée par RocR. A la différence des autres gènes dépendant de sigma 54, rocG n'a pas d'UAS et son expression dépend d'une séquence appelée DAS, localisée en aval du gène rocG et qui sert d'UAS pour le promoteur de l'opéron rocABC. La protéine RocR a été purifiée et il a été montré par des expériences d'empreintes à la DNAseI qu'elle se fixe sur l'ADN sur deux régions palindromiques de 17 paires de bases appelées UAS/DAS. Des mutations ont été introduites par mutagénèse dirigée dans chacune de ces deux cibles de RocR et il a été montré que ces mutations affectent simultanément l'expression du gène rocG et celle de l'opéron rocABC. En collaboration avec Eric Larquet (Institut Pasteur), une étude de la structure de l'ADN de la région rocG rocABC a été entreprise. Cette étude a permis de montrer l'existence d'une courbure stable localisée dans la région UAS/DAS. Cette courbure permet d'expliquer comment la protéine RocR interagissant avec les UAS/DAS, stimule l'ARN polymérase fixée au promoteur de l'opéron rocABC.

Réponse à l'environnement chez Bacillus subtilis et d'autres bactéries Gram-positives (T. Msadek , A. Chastanet, S. Dubrac, J. Fert, E. Guédon, O. Poupel)

Les travaux concernent l'étude de la régulation de l'expression génétique en réponse à des signaux de l'environnement, notamment la réponse aux stress et la transmission de signaux par les sytèmes à deux composants chez Bacillus subtilis et des bactéries pathogènes à Gram-positif (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae et Listeria monocytogenes).

Nous avons récemment caractérisé le régulon CtsR de Streptococcus pneumoniae et Staphylococcus aureus. Dans ces deux bactéries, nous avons mis en évidence par génomique comparative, des voies nouvelles et originales de régulation des gènes de réponse aux stress, notamment des exemples de gènes soumis à une double régulation négative par CtsR et un deuxième répresseur, HrcA.

Ces résultats ont été confirmés par des approches in vivo et in vitro et indiquant que chez S. pneumoniae, l'expression de l'opéron codant pour les protéines chaperons GroESL dépend à la fois de CtsR et HrcA. Il a par ailleurs été montré que ClpP de S. pneumoniae joue un rôle dans l'expression des gènes de compétence et que ClpE et ClpC sont toutes deux importantes pour la virulence d'une souche capsulée.

Chez S. aureus, la construction de mutants d'inactivation simple et double (*ctsR, *hrcA, *ctsR *hrcA) ainsi qu'une approche in vitro (empreintes à la DNaseI en présence des deux répresseurs purifiés, CtsR et HrcA) a permis de démontrer que l'ensemble du régulon HrcA (opérons groESL et dnaK) est inclus dans le régulon CtsR, qui comprend en outre les gènes clpP, clpB et l'opéron clpC

Le groupe est impliqué dans l'analyse génomique fonctionnelle chez trois bactéries à Gram-positif : Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes et Streptococcus agalactiae, et notamment dans l'étude des régulons contrôlés par les systèmes à deux composants par analyse du transcriptome.

Chez Listeria monocytogenes, un gène codant pour le régulateur de réponse d'un système à deux composants qui répondrait à la présence d'un peptide extracellulaire auto-inducteur de type " quorum-sensing " a été inactivé. Les cibles contrôlées par ce système sont en cours d'identification par l'étude du transcriptome.

Les bactéries à Gram-positif possèdent un système à deux composants qui se révèle essentiel à la survie de la bactérie, le système YycG/YycF. Les protéines YycG (histidine kinase) et YycF (régulateur de réponse) de Staphylococcus aureus ont été surproduites et purifiées. YycG est autophosphorylée in vitro en présence de [g-32P] ATP, et transfère son groupement phosphate au régulateur de réponse YycF. YycG a été testée in vitro comme cible de nouveaux agents antibactériens et plusieurs molécules pouvant inhiber son activité kinase ont été identifiées. Les protéines analogues de B. subtilis ont été purifiées et utilisées dans des expériences d'interactions protéine/ADN in vitro (retard de migration sur gel, empreinte à la DNaseI). Une évaluation de ces molécules en tant qu'agents antibiotiques est en cours.

Etude de la pathogénicité de Staphylococcus aureus (M. Débarbouillé, M. Arnaud, J. Bignon, B. Fournier)

S. aureus est une bactérie pathogène importante impliquée dans un grand nombre d'infections chez l'homme, allant des lésions superficielles à des infections plus graves, telles que les ostéomyélites, endocardites, pneumonies, septicémies et le syndrome du choc toxique. En dépit d'efforts intensifs, en particulier sur l'étude du système agr, peu de données sont disponibles sur les bases moléculaires de la pathogénicité et sur la façon dont la bactérie envahit l'organisme et échappe au système immunitaire.

1 - Construction d'un vecteur efficace pour l'inactivation des gènes

L'inactivation des gènes étant un événement relativement peu efficace chez S. aureus, un nouveau vecteur plasmidique appelé pMAD a été construit au laboratoire. Il porte une origine de réplication thermosensible et un gène exprimant une béta-galactosidase de façon constitutive permettant une détection rapide et simple d'événement de double recombinaison sur milieu salin contenant du X-Gal. Ce nouveau plasmide a été testé avec succès chez S. aureus et L. monocytogenes. Plusieurs gènes potentiellement impliqués dans la virulence de S. aureus ont ainsi été étudiés.

2 - ABC transporteurs

Les oligopeptides perméases (Opp) sont des membres d'une famille de transporteurs à large spectre. Ces perméases transportent généralement des peptides de trois à huit aminoacides comme le CSF (Competence and Sporulation Factor) de B. subtilis, qui est impliqué dans le contrôle de l'expression de gènes régulés par " quorum sensing ". Cinq gènes similaires des gènes de l'opéron oppABCDF de B. subtilis sont présents chez S. aureus. Cet opéron de type Opp a été inactivé et la virulence du mutant a été étudiée dans le modèle murin, en collaboration avec l'équipe de Jean-Michel Alonso. Les résultats obtenus ont montré que cet opéron n'est pas impliqué dans la virulence. Cependant, une dizaine de systèmes de type Opp sont présents chez S. aureus et leur étude est en cours.

3 - Rôle de la sérine protéase HtrA

HtrA est une protéase membranaire induite par le choc chez E. coli, où il a été montré qu'elle intervenait dans la dégradation des protéines périplasmiques anormales. HtrA est également impliquée dans la virulence chez Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica et Brucella abortis. Chez S. aureus, deux gènes codant pour des protéases de type HtrA existent et rien n'est connu concernant leurs rôles et la régulation de ces gènes. Nous avons pu montrer que les deux gènes correspondants ne sont pas induits par la température et leur induction dans différentes conditions de stress est en cours d'étude, en collaboration avec Alexandra Gruss (INRA, Jouy-en-Josas).

4 - Etude du système à deux composants ArlS/ArlR

Le système ArlS/ArlR, intervient dans la virulence de S. aureus en réprimant l'expression des gènes de certains facteurs de virulence comme la protéine A et la toxine a. Le système Arl semble agir sur l'expression des gènes de virulence par l'intermédiaire de SarA (un régulateur global de la virulence). L'étude du système Arl par analyse protéomique des protéines cytoplasmiques montre qu'au moins 15 protéines sont régulées par ce système et la majorité d'entre elles sont réprimées par ce système. L'identification de ces protéines est en cours. Cette caractérisation permettra d'identifier les éléments du régulon contrôlé par ArlS/ArlR et ainsi contribuera à une compréhension de la virulence et de sa régulation chez cette bactérie.

Régulation de l'expression des gènes impliqués dans la différenciation chez Streptomyces (P. Mazodier, A. Bellier, S. Braud, J. Viala)

Les Streptomyces ont un cycle morphologique complexe proche de celui des champignons filamenteux. Ce cycle passe par la formation d'un mycélium basal, puis d'un mycélium aérien ; celui-ci subit ensuite une septation pour se différencier en spores. Cette différenciation morphologique est accompagnée d'une différenciation métabolique qui fait des Streptomyces le genre bactérien le plus riche en producteur d'antibiotiques.

Nous avons poursuivi l'analyse des protéases ATP-dépendantes. La protéase Lon a été étudiée. Le gène lon appartient au régulon dnaK clpB. L'obtention d'un mutant lon a permis la construction de mutants de l'opéron dnaK qui n'avaient pu être isolés précédemment.

Par ailleurs, un autre système protéasique étudié dans l'Unité, est le complexe protéolytique Clp comprenant la protéase ClpP associée aux sous-unités régulatrices ClpB, ClpC ou ClpX. Chez S. lividans, cinq gènes clpP sont présents. ClpP1 est impliquée dans la différenciation morphologique et la production d'antibiotiques. L'opéron clpP3 clpP4 est régulé par l'activateur PopR. Nous avons montré que les protéases ClpP dégradent PopR, ce qui permet l'expression contrôlée de l'opéron clpP3 clpP4. Une mutation affectant la sous-unité régulatrice ClpX a été également obtenue ; le phénotype de ce mutant n'est pas identique à celui des mutants clpP, ce qui montre que les deux sous-unités ClpC1 et ClpC2 doivent aussi être fonctionnelles.

D'autre part, nous avons débuté l'étude du système ssrA chez Streptomyces. L'ARN codé par ssrA possède les propriétés mixtes d'un tARN et d'un ARN messager. Il permet l'étiquetage spécifique des protéines dont la biosynthèse est arrêtée au cours de la traduction. Ces peptides sont adressés pour une dégradation par protéolyse. Chez E. coli, le complexe Clp est majoritairement impliqué dans cette dégradation. Les premiers résultats obtenus indiquent que le système ssrA ne semble toutefois pas impliqué dans la différenciation des Streptomyces.

Régulation de l'expression du régulon PlcR chez les bactéries du groupe Bacillus cereus (D. Lereclus, M. Gominet, V. Sanchis, L. Slamti)

PlcR est un régulateur pléiotrope qui active la transcription de nombreux gènes de virulence chez Bacillus thuringiensis et Bacillus cereus. L'analyse de la séquence du génome de B. cereus et du protéome extracellulaire indiquent que 42 gènes sont potentiellement régulés par PlcR. La délétion du gène plcR chez ces bactéries conduit à une diminution du pouvoir pathogène chez l'insecte et la souris.

L'expression du régulon PlcR est contrôlée à deux niveaux :

1 - Le facteur clé responsable de l'initiation de la sporulation, Spo0A, réprime l'expression du gène plcR au moment où la bactérie commence à s'engager dans le processus de sporulation. Cette répression est due à la fixation de Spo0A~P sur deux séquences situées de part et d'autres de la cible reconnue par PlcR pour sa propre activation.

2 - Un gène (papR) lui-même régulé par PlcR, conduit à la synthèse d'un peptide de 48 acides aminés portant une séquence signal d'exportation. Une partie du peptide est donc diffusible dans le milieu extracellulaire et peut être réimportée dans la cellule bactérienne, sous forme d'un pentapeptide, via le système de perméation Opp. Le pentapeptide interagit avec la protéine PlcR permettant ainsi sa fixation sur les séquences d'ADN cible. Ce système de signalisation moléculaire permet aux bactéries de produire un ensemble de facteurs de virulence quand leur densité dans le milieu est suffisante (quorum sensing).

L'ensemble de ces résultats apporte des informations essentielles pour la compréhension des mécanismes de régulation du pouvoir pathogène chez les bactéries Gram-positives.

 

Photo

Analyse du régulon DegS/DegU chez Bacillus subtilis par l'étude du transcriptome. L'ensemble des 4107 gènes de Bacillus subtilis est présent sur une membrane à haute densité. Les points rouges indiquent les gènes dont l'expression est réprimée par DegU, les points verts ceux dont l'expression est activée par le système DegS/DegU, les points jaunes les gènes qui ne sont pas contrôlés par DegU et les points noirs les gènes qui ne sont pas exprimés dans les conditions utilisées.



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DEBARBOUILLE Michel, DR2 CNRS, mdebarbo@pasteur.fr

FOURNIER Bénédicte, Chargé de Recherche IP, bfournie@pasteur.fr

KLIER André, Professeur Université Paris 7, aklier@pasteur.fr

LERECLUS Didier, DR1 INRA, lereclus@pasteur.fr

MAZODIER Philippe, Chef de Laboratoire IP, mazodier@pasteur.fr

MSADEK Tarek, Chargé de Recherche IP, tmsadek@pasteur.fr

RAPOPORT Georges, DR1 CNRS, Professeur IP, rapoport@pasteur.fr

SANCHIS Vincent, CR1 INRA, vsanchis@pasteur.fr

BELLIER Audrey, Etudiante en thèse, abellier@pasteur.fr

BRAUD Sandrine, Chercheur post-doctoral, sbraud@pasteur.fr

CHASTANET Arnaud, Etudiant en thèse, achastan@pasteur.fr

DUBRAC Sarah, Chercheur post-doctoral, sdubrac@pasteur.fr

ESPINASSE Sylvain, Etudiant en thèse

OULD ALI Naima, Etudiante en thèse, nalison@pasteur.fr

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VIALA Julie, Etudiante en thèse, jviala@pasteur.fr

ARNAUD Maryvonne, Ingénieur de Recherche IP, marnaud@pasteur.fr

BIGNON-TOPALOVIC Joëlle, Technicienne Supérieure IP, jojo@pasteur.fr

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