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  Responsable : GACHELIN Gabriel, directeur par intérim (ggachell@pasteur.fr)


  resume

 

Les activités de recherche menées en 2001 au sein de l'Unité de Biologie Moléculaire du gène, INSERM U277 concernent les mécanismes fondamentaux de la réponse immunitaire et se prolongent dans l'analyse de situations pathologiques en particulier chez l'homme. Bien qu'ayant trait a des aspects aussi différents de l'immunologie que les lymphocytes intra-intestinaux et la réaction inflammatoire ont été très largement basées sur un ensemble de techniques mises au point dans le laboratoire, comme l'Immunoscope de première et maintenant de seconde génération. Cet ensemble de techniques désormais bien codifié permet d'étude de variations -même mineures- des clones individuels de lymphocytes T et de lymphocytes B. Ces techniques sont désormais appliquées en routine à l'étude de différentes situations physio-pathologiques, humaines et murines, observées ou induites, au suivi de protocoles immunothérapeutiques chez l'homme ainsi qu'à la différentiation de populations lymphocytaires T et plus récemment des lymphocytes B, ainsi que des cellules mémoire. Enfin, une technique de repérage des zones de l'ADN génomique activées au cours d'une étape de différenciation a été mise au point et appliquée à la description moléculaire des la sélection des cellules Th1 et Th2 ainsi que des cellules mémoire.



  rapport

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Groupe 1 dirigé par Delphine Guy-Grand : Lymphocytes intra-intestinaux

ONTOGENESE DES LYMPHOCYTES INTRA-EPITHELIAUX (LIE) DE LA MUQUEUSE DIGESTIVE.

Les LIE constituent une population lymphocytaire particulière à plusieurs égards: localisation à proximité immédiate de la source d'antigènes; prédominance de lymphocytes T CD8 avec un phénotype hétérogène (CD8ab TCRab, CD8aa TCRab ou gd); persistance chez les sujets athymiques de LIE CD8aa (en majorité TCRgd), indiquant l'existence d'une voie de différenciation extra-thymique. Nos études portent actuellement sur l'évaluation de l'origine thymique ou extra-thymique des LIE CD8aa (les LIE CD8ab étant issus de la voie thymique dite "double positive"). Utilisant des souris transgéniques euthymiques ou nude dont tous les lymphocytes T expriment le même TCR autoréactif (transgène TCRab anti-HY sur fond génétique RAG-/-), nous avons mis en évidence l'existence de LIE CD8aa d'origine thymique, issus d'une voie "double négative". Cette voie semble aussi exister chez les animaux non trangéniques, en particulier pour les LIE TCRab, et prédominer quantitativement sur la voie de différenciation extra-thymique, contrairement à ce qui est usuellement accepté.

Groupe 2 dirigé par Laurent Ferradini: Immunologie des tumeurs

ANALYSE DES REPONSES T ANTITUMORALES - SUIVI DE PROTOCOLES D'IMMUNOINTERVENTION

Le projet du groupe d'immunologie des tumeurs s'articule autour de trois axes. Le premier consiste en la mise en place d'un modèle de mélanome inductible in vivo chez la souris dans le but d'étudier la réponse antitumorale dirigée contre un antigène tumoral connu (GP- LCMV) au cours du développement progressif d'une tumeur. Ce modèle transgénique devrait nous permettre de suivre et de caractériser la réponse antitumorale spécifique à l'aide des tétramères et de l'Immunoscope mais aussi grâce à l'utilisation des méthodes d'analyse multiparamétriques de l'expression des gènes et des protéines (cDNA microarrays, ProteinChips®). Le but est de caractériser les cellules T spécifiques impliquées in situ dans une réponse antitumorale efficace et de préciser leur état d'activation et de différentiation. Le deuxième axe vise à analyser la réponse antitumorale T au cours du mélanome chez l'homme et plus spécifiquement les réponses MHC classe II restreintes. Pour cela, nous avons produit différents tétramères MHC de classe II (DR4, DR7 et DP4) afin de suivre les réponses T CD4+ dans divers modèles connus d'antigènes tumoraux (MAGE-3, MelanA/Mart1, NY-ESO-1). Par ailleurs, nous étudions le répertoire des lymphocytes T mémoires afin de comprendre la dynamique des populations mémoires chez les sujets normaux ou cancéreux. Enfin, le dernier axe de recherche plus appliqué consiste grâce à la plate-forme d'immunoscopie avancée au suivi immunologique des réponses lymphocytaires T spécifiques d'antigènes tumoraux chez de patients cancéreux traités par immunothérapie.

Groupe 3 dirigé par Gabriel. Gachelin : Lymphocytes NKT

CELLULES NKT A REACTIONS INFLAMMATOIRES

Le groupe s'est très largement consacré à l'étude du rôle des cellules Natural killer T cells (NKT) restreintes par la molécule d'histocompatibilité monomorphe CD1d1, en physiopathologie. Après avoir montré que ces cellules étaient recrutées très activement sur des sites inflammatoires aigus induits par des glycolipides bactériens ou des infections bactériennes, mais pas sur des lésions inflammatoires chroniques, il a été montré que ces cellules fonctionnaient comme des cellules inflammatoires et migraient, indépendamment de leur élément de restriction, vers le site inflammatoire aigu. Les lymphocytes NKT sont donc un nouveau type de cellules inflammatoires caractérisées par leur capacité à produire de l'IL4 et de l'IFNgamma sans stimulation antérieure. Des études en cours ont montré la précocité de leur recrutement in situ, de l'ordre de quelques heures, et défini les cytokines et chimiokines produites localement. L'étude des récepteurs de chimiokines des différentes sous-populations de cellules NKT a montré un profil d'expression spécifique d'organe, qui très probablement sous-tend des différences fonctionnelles. L'étude de l'activation in vivo des NKT par les cellules de Kupffer activées par des glycolipides est en cours. Des réactifs fluorescents ont été synthértisés qui permettent de suivre le comportement et le métabolisme des molécules affines pour CD1d1, comme l'alpha galactosyl ceramide. Enfin,, une étude placée dans le cadre de l'évolution du système immunitaire articles et portant sur les relations entre poissons et cyclostomes plus primitifs.a été récemment terminée en concluant à la monophylie des poissons sans machoires.

Groupe 4 dirigé par Jean Kanellopoulos : Etude des répertoires des lymphocytes T de souris

Dans le prolongement de nos travaux antérieurs, nous analysons chez la souris, la sélection des répertoires des lymphocytes T et le rôle des cellules thymiques nourricières dans la sélection thymique.

1) Etude du répertoire des lymphocytes T chez les souris dont le gène codant la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) a été invalidé. Dans une première série de travaux, nous avons estimé la taille du répertoire des lymphocytes T chez les animaux TdT°/°. Nos études ont montré que la taille du répertoire  chez ces souris est diminuée d'un facteur 10 à 15 par rapport à des animaux TdT+/+ (Cabaniols,J-P, Fazilleau, N, et al. J.Exp.Med. (2001) 194:1385). Nous comparons le répertoire des lymphocytes T de souris TdT°/° et C57Bl/6 en réponse à des antigènes protéiques présentés par les molécules de classe I et II du CMH. Pour cela, nous isolons les cellules T spécifiques d'un épitope bien défini à l'aide de tétramères classe I ou II du CMH. Les réarrangements des lymphocytes spécifiques sont ensuite séquençés et comparés. Nous analysons quels types de réarrangements sont utilisés et comment évolue le répertoire T en réponse secondaire.

2) Mise en évidence de gènes spécifiques de cellules épithéliales thymiques et de cellules thymiques nourricières (TNC). Nous avons utilisé la méthode "Representational Difference Analysis" qui permet d'identifier et cloner des gènes qui sont exprimés de façon différentielle par une sous-population donnée de cellules d'un organisme. Nous l'avons appliquée aux TNC et nous avons isolé deux séquences, l'une codant la synaptotagmine I et l'autre, une "Cystein Rich Protein" (CRP). La synaptotagmine I est exprimée dans le système nerveux central, dans les cellules de la médullo-surrénale et dans les ilôts du pancréas. A l'aide d'anticorps anti-synaptotagmine I, nous voulons identifier et localiser les cellules épithéliales thymiques qui l'expriment. De plus, chez les souris dont le gène codant la synaptotagmine I a été invalidé, nous déterminerons si l'absence de cette molécule a des conséquences phénotypiques et fonctionnelles sur le thymus et les thymocytes. La CRP que nous avons identifiée est une nouvelle isoforme de CRP, strictement exprimée dans les cellules épithéliales du thymus. A l'aide d'anticorps, nous avons montré que la CRP est présente dans les TNC et dans une sous-population de cellules épithéliales du cortex thymique.

Equipe F. Huetz : Etude des répertoires des lymphocytes B humains

La technique de l'Immunoscope, qui permet l'étude des répertoires lymphocytaires par la détermination de la taille des régions CDR3 du TCR ou du BCR a été ces dernières années principalement appliquée à l'étude des cellules T. Nous l'avons adaptée aux cellules B de l'homme en y associant une détermination quantitative de l'usage des différentes familles de gène VH par PCR quantitative en temps réel suivie " d'Immunoscope II " qui étend l'analyse des lymphocytes B à la séquence de leurs réarrangements (FR1à CDR3).

Cette technique devrait nous permettre de déterminer tout d'abord la taille du répertoire des cellules B et ses variations en condition physiologique. La contribution des mutations somatiques (caractéristique unique des cellules B) à la diversité du répertoire sera également évaluée et la diversité du répertoire des cellules B mutées sera déterminée pour être ensuite comparée à la diversité totale. Dans un deuxième temps, nous allons également étudier ces populations dans des situations pathologiques où leurs proportions sont modifiées. Ce travail, qui sera par la suite mis au point chez la souris, devrait nous permettre d'avancer dans nos connaissances du mode de fonctionnement des cellules B " mémoires " dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

Groupe 5 dirigé par Christophe Pannetier et Philippe Kourilsky : Analyse des populations de lymphocytes T mémoire et effectrices et étude des bases moléculaires de leur phénotype.

La station de suivi de la réponse T cytotoxique, développée avec le soutien de la ligue contre le cancer, a été validée dans le cadre d'un essai clinique d'i

mmunothérapie du mélanome dirigée par la société IDM. Cette station permet de détecter dans le sang d'un patient, puis de suivre au cours du temps, pendant la durée d'un traitement par exemple, les clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques d'antigènes dont la fréquence est supérieure ou égale à 10-5. L'ensemble du procédé sera publié dans le Journal of Immunological Methods au début 2002. Cette station sera ensuite valorisée par le Centre de Recherche Clinique de l'Institut. Dans la perspective d'étudier l'impact d'une pathologie tumorale ou des traitements anticancéreux sur le compartiment des lymphocytes T mémoire CD8+, l'étude du répertoire de ces lymphocytes a été poursuivie chez des donneurs sains. Les sous-répertoires des populations CD62L+ et CD62L- ont été ainsi caractérisés et leur évolution au cours du temps a été étudiée.

Enfin, cette équipe a poursuivi l'étude visant à localiser les changements de l'état de méthylation dans le génome survenant au cours de la différentiation des lymphocytes T naïfs murins en cellules T effectrices ou mémoire. Cette étude est menée en collaboration avec le laboratoire d'immunology du NIAID, et l'unité INSERM U345. La méthode RLGS-M utilisée (voir photo) a déjà permis de repérer plusieurs marqueurs génétiques identifiant des régions différentiellement méthylées entre des populations de lymphocytes Th1 et Th2 dans un premier modèle ou CD8+ naïfs et mémoire dans un second modèle. Le clonage et la validation de ces marqueurs sont en cours.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Viviane CAPUT, TCE CNRS – caput@pasteur.fr

Jos EVEN, CR1 CNRS

Laurent FERRADINI, CR1 INSERM

Gabriel GACHELIN, Chef de Labo IP

Delphine GUY-GRAND, DR0 INSERM

Jean KANELLOPOULOS, Professeur, Orsay

Philippe KOURILSKY, Professeur, Collège de France

Iris MOTTA, CR1 INSERM

David OJCIUS, Professeur, Paris VII

Christophe PANNETIER, CR DGA

Nathalie PARDIGON, CR IP

Véronique BARON, doctorante, bourse CIFRE

Cécile BOUNEAUD, doctorante, bourse DGA

Min-Sun CHO, post-doc, poste vert INSERM

Nicolas FAZILLEAU, doctorant, bourse MNERT

Martin MEMPEL, post-doc, bourse CE

Cahterine RONET, doctorante, bourse MNERT

Nathalie THIEBLEMONT, post-doc, bourse ARC

Viviane CAPUT, TcE CNRS

Armanda CASROUGE, IE INSERM

Sylvie DARCHE, IE INSERM

Christiane DELARBRE, IR CNRS

Sacha GARCIA, T INSERM

Fabrice LEMAITRE, AI INSERM

Annick LIM, Ingénieur IP


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