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  Responsable : DEUBEL Vincent (vdeubel@cervi-lyon.inserm.fr)


  resume

 

Le laboratoire P4 " Jean Mérieux " est une structure unique en Europe offerte à la communauté scientifique pour que des équipes et des chercheurs performants puissent y développer des études sur les agents pathogènes de classe 4. Le laboratoire appartient à la Fondation Mérieux qui en assure la maintenance et la biosécurité. La responsabilité scientifique du laboratoire P4 est assurée par l'Institut Pasteur. Une Association entre les deux Fondations, Mérieux et Pasteur, a été créée le 10 Octobre 2000 et porte le nom de " Centre de Recherche Mérieux Pasteur à Lyon " (CRMPL).

L'équipe scientifique de l'Institut Pasteur est rassemblée dans l'Unité de Biologie des Infections Virales Emergentes (UBIVE) à laquelle sont rattachés le Centre National de Référence (CNR) et le Centre Collaborateur OMS (CCOMS) des Arbovirus et des Fièvres Hémorragiques Virales. L'UBIVE fait à la fois partie du Département de Virologie de l'Institut Pasteur à Paris et de l'IFR74 " Centre d'Etude et de Recherche en Virologie et Immunologie " dirigée à Lyon par l'INSERM.

Grâce au laboratoire P4 et à son environnement scientifique sur le site Gerland à Lyon-Sud (Ecole Normale Supérieure, Institut de chimie et de biologie des protéines, Université Claude Bernard Lyon I, …) à Marseille, à Grenoble, et à Montpellier, le CRMPL représente pour l'Institut Pasteur et la Fondation Mérieux un pôle stratégique déterminant dans le Sud de la France et une porte ouverte pour l'Europe vers les pays du Sud. L'UBIVE, avec l'aide du CNR et du CCOMS représente un centre d'information, de formation et de référence pour les laboratoires de virologie du Réseau International des Instituts Pasteur. L'UBIVE, grâce également à ses contacts privilégiés avec le Réseau Européen des Maladies Virales d'Importation (ENIVD) et le Pôle OMS d'Alerte et de Réponse aux Epidémies, localisé à Lyon, a pour objectifs de devenir le Centre français et européen de référence pour les maladies virales émergentes et les zoonoses. Il répond à ces objectifs avec des études sur les virus de la dengue, de la fièvre jaune, West Nile, Puumala, Lassa et Nipah. Le CRMPL doit également attirer des collaborations européennes et offrir, avec le laboratoire P4 et son savoir-faire, un plateau technique de confinement maximum pour les expérimentations in vitro et animales nécessaires aux études de la pathogenèse des fièvres hémorragiques et des encéphalites virales pour le développement de thérapeutiques et de prophylaxies adaptées.



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I. Le laboratoire de haute sécurité P4

1. Activités de diagnostic (M-C. Georges, H. Zeller, P. Marianneau, I. Marendat, S. Lacote)

Le laboratoire P4 doit répondre à des exigences de diagnostic rapide de fièvres hémorragiques et d'encéphalites sur des échantillons de patients situés dans des zones endémo-épidémiques, ou sur des cas d'importation. Nous développons actuellement des outils standards et moléculaires pour le diagnostic sérologique des virus de classe 4 (Ebola, Marburg, Lassa, fièvre hémorragique de Congo-Crimée, Nipah). Les réactifs mis au point permettent à présent d'assurer le diagnostic rapide des agents P4. Ils sont également disponibles pour les laboratoires du réseau international des Instituts Pasteur, pour d'autres laboratoires situés en zones endémo-épidémiques, et pour les laboratoires de l'ENIVD.

Dans le cadre d'un programme européen, nous avons mis au point un nouveau test de diagnostic basé sur la détection des génomes viraux par RT-PCR après capture des virus par des polymères fixés sur des billes magnétiques. Ce nouveau test est simple, fiable et peut être utilisé sur le terrain. Les polymères magnétiques pour la capture des particules virales ont été développés par l'Unité mixte CNRS-BioMérieux UMR503 à Lyon. Nous avons testé la technique d'amplification génique par RT-PCR pour le diagnostic des virus fièvre jaune, Ebola, Lassa, fièvre hémorragique de Congo-Crimée. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus par des techniques classiques de RT-PCR et de titrage viral et les différentes étapes du processus expérimental ont été optimisées en vue d'une utilisation sur le terrain. Pour cela, différentes missions ont été entreprises notamment en Guinée, en Côte d'Ivoire et au Gabon où nous avons pu disposer de sérums de patients collectés au cours des épidémies de fièvre de Lassa, fièvre jaune et Ebola.

Afin de mettre au point un test ELISA pour la détection des IgG et IgM dans le sérum des patients infectés par le virus Lassa, les protéines NP et GP ont été produites en cellules d'insectes par le système d'expression du baculovirus. L'analyse de la réactivité antigénique des protéines purifiées contre les anticorps anti-Lassa obtenus à partir de cobayes infectés ou de patients est en cours.

(Collaborations : B. Mandrant, C. Akoua-Koffi, L. Koivogui, E. Leroy, A. Sall)

2. Activités de recherche sur le virus Lassa

Dès le démarrage effectif du laboratoire P4 en décembre 2000, des études de la pathologie de la fièvre hémorragique de Lassa ont été initiées avec pour objectifs la mise au point de prophylaxies vaccinales et de traitements contre cette maladie. La fièvre de Lassa est une maladie émergente, endémique dans plusieurs pays d'Afrique de l'Ouest, associée à une morbidité et une mortalité importantes. L'OMS estime à plusieurs centaines de milliers le nombre de cas de fièvre de Lassa et à 5000 le nombre de décès annuels. Plusieurs cas d'importation par des voyageurs infectés se sont produits ces dernières années en Europe. Les signes cliniques graves de la maladie, après un début lent des symptômes fébriles de type pseudo-grippal, aboutissent à des diarrhées, vomissements, œdème facial et cervical, hémorragies sous-conjonctivales et parfois des saignements. Les malades meurent en général d'un choc hypovolémique et d'une détresse respiratoire.

Le virus responsable de cette pathologie appartient à la famille des Arenaviridae. Il est transmis à l'homme par l'intermédiaire de son réservoir naturel, le rongeur commensal de l'espèce Mastomys, mais peut également se transmettre d'homme à homme par contact cutané ou muqueux. A ce jour, il n'existe aucun vaccin contre ce virus. Le seul traitement disponible, la Ribavirine, présente les inconvénients de devoir être administré très précocement après l'infection, de présenter une toxicité non négligeable et d'être d'un coût élevé.

 

A- Etude de la réponse immunitaire à l'infection par le virus Lassa

(S. Baize, I. Grosjean, M-C. Georges)

La réponse immune induite au cours de la fièvre de Lassa est peu connue, mais est probablement impliquée dans la survie ou la mort des patients. Les cellules dendritiques et les macrophages ont un rôle crucial dans l'induction et la régulation de la réponse immune, et ces derniers sont des cibles connues du virus Lassa. Nous nous intéressons aux interactions du virus Lassa avec les cellules dendritiques (obtenues à partir de monocytes sanguins différenciés en présence de GM-CSF et d'IL-4) et avec les macrophages (différenciés en présence de M-CSF).

Les résultats préliminaires d'immunofluorescence, de cytométrie en flux et de titrage viral dans les surnageants de culture ont démontré la sensibilité des cellules dendritiques et des macrophages à l'infection par le virus Lassa. De plus, l'étude de l'expression des molécules d'activation, de co-stimulation et d'adhésion à la surface des cellules a mis en évidence une activation des cellules dendritiques et des macrophages en réponse à l'infection virale. Les cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires produites par les cellules infectées seront prochainement étudiées par RT-PCR et ELISA. De même, l'étude des interactions entre les cellules dendritiques ou les macrophages infectés et les lymphocytes T sera également envisagée.

Cette étude permettra de connaître les conséquences du tropisme viral pour des cellules présentatrices d'antigène sur l'induction de la réponse immune et de mettre en évidence une possible implication des cellules immunitaires dans les phénomènes physiopathologiques survenant au cours de l'infection.

B- Etude de la réponse des cellules endothéliales à l'infection par le virus Lassa

(P. Marianneau, P. Loth)

Ce projet concerne l'étude des causes de l'augmentation de la perméabilité vasculaire au cours de l'infection par le virus Lassa. Nous comptons par des études in vitro dans les cellules endothéliales humaines de différents tissus, vérifier si la réponse des cellules à l'infection par le virus ou à des médiateurs solubles libérés par des monocytes/macrophages infectés a un rôle dans la perméabilité vasculaire.

Ces études permettront une meilleure connaissance des mécanismes de réponse de l'hôte à l'infection et d'une éventuelle implication des cellules immunitaires et endothéliales dans la pathogenèse. Ces recherches seront également utiles pour développer une prophylaxie appropriée contre la fièvre de Lassa.

C- Etude d'anti-viraux contre les arénavirus (F. Martineau, I. Grosjean)

L'objectif de cette étude est de rechercher de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement des fièvres hémorragiques liées aux arénavirus. Seules les fièvres hémorragiques à hantavirus et de Lassa peuvent être traitées grâce à la Ribavirine, une molécule analogue de la guanosine. Toutefois, pour être efficace, elle doit être administrée dès les premiers jours de la maladie. Cette molécule présente un certain degré de toxicité d'autant qu'elle doit être administrée à haute dose. De plus, elle ne peut pas atteindre le système nerveux central et par conséquent n'est pas efficace contre les encéphalites liées aux virus. Une approche thérapeutique implique l'étude de l'efficacité antivirale d'autres molécules.

Notre première approche thérapeutique des arénavirus est actuellement réalisée en prenant comme modèle le virus Ippy, un arénavirus de classe 2. Les molécules qui présenteront un potentiel antiviral important et une toxicité minimale pour la cellule Vero in vitro seront ensuite testées dans le laboratoire P4 vis-à-vis du virus Lassa et dans différents systèmes de cellules humaines cibles pour ce virus : cellules dendritiques, macrophagiques, et endothéliales. Les molécules qui présentent un effet virostatique seront testées chez le cobaye.

3. Activités de recherche sur le virus Nipah (I. Grosjean, P. Loth, M-C. Georges)

Le virus Nipah a été identifié pour la première fois en Malaisie en 1998 et 1999. Le virus a été initialement la cause d'une épidémie chez les porcs puis chez l'homme après contact avec les animaux infectés. Sur 265 cas recensés, 105 malades sont décédés dans un tableau d'encéphalite aiguë. Les porcs ont manifesté essentiellement un syndrome respiratoire avec un taux de mortalité de 5%. Le virus a ensuite été isolé de l'urine de roussettes (ptéroptères) qui semblent être le réservoir du virus.

Les structures du génome, ARN monocaténaire de sens négatif, et du virion enveloppé d'apparence pléomorphique de 100 à 500 nm de diamètre, ont classé le virus Nipah dans la famille des Paramyxoviridae. Ce virus du genre hénipavirus se distingue des autres genres de la famille (rubulavirus, paramyxovirus, morbillivirus) non seulement par une divergence nucléotidique supérieure à 50% et l'absence de réaction sérologique croisée, mais également par une longueur de génome supérieure d'environ 3000 nucléotides et par l'absence d'activités neuraminidase et hémagglutinine. Le virus est pléïotrope mais induit une nécrose des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins et a une prédilection pour le système nerveux central.

La pathogénicité du virus Nipah pour les cellules neuronales est actuellement étudiée in vitro et in vivo avec pour objectif le développement des molécules thérapeutiques. De plus, les outils qui seront développés au cours de cette étude permettront d'effectuer une surveillance de la circulation du virus en Asie et une recherche de nouveaux réservoirs potentiels.

(Collaborations : Fabian Wild, Robin Buckland, Sai Kit Lam, Kow Bin Chua)

 

II. Le Centre National de Référence des arbovirus et des fièvres hémorragiques virales

En attendant la réalisation d'un laboratoire P3 nécessaire aux activités du Centre de référence des arbovirus, la majeure partie des activités du CNR concernant les virus de classe 3 s'est effectuée à l'Institut Pasteur à Paris.

1. Détection et investigation d'épidémies (B. Murgue, S. Murri, D. Coudrier, I. Marendat, H. Zeller)

Suite à l'épizootie West Nile apparue durant l'automne 2000 dans les départements de l'Hérault et du Gard, différentes enquêtes épidémiologiques ont été menées incluant plusieurs partenaires (Ministère de l'Agriculture, AFSSA, Ministère de la Santé, CIRAD) et dans lesquelles le CNR a été largement impliqué tant au niveau de la conception des projets qu'au niveau de la réalisation : enquête de séroprévalence chez les chevaux, enquête sur l'avifaune en 2000 et programme de surveillance de l'avifaune en 2001.

Les virus West Nile France 2000 et Tunisie 1997 ont été séquencés dans leur totalité, l'analyse est en cours.

En avril 2001, quelques cas de fièvre avec ictère sont décelés en Côte d'Ivoire, l'Institut Pasteur d'Abidjan évoque la fièvre jaune, ce qui sera confirmé par le CNR. Tous les prélèvements ultérieurs de cas suspects seront envoyés au CNR pour confirmation. Une mission effectuée en octobre 2001 (P. Marianneau, UBIVE, et A. Sall, Institut Pasteur de Dakar) a permis la mise en place de la RT-PCR à l'Institut Pasteur d'Abidjan. Le virus de la fièvre jaune a pu ainsi être détecté dans quelques sérums.

Durant toute l'année 2001, le CNR a été impliqué dans le suivi de l'épidémie de fièvre jaune apparue en Guinée en octobre 2000.

(Collaborations : J. Hars, S. Zientara, C. Akoua-Koffi, L. Koivogui)

2. Etude clinique et épidémiologique de la dengue : dengue d'importation et dengue en zone d'endémie (B. Murgue, H. Zeller)

Une étude prospective de la dengue d'importation en France métropolitaine a été réalisée en 2000 en collaboration avec le laboratoire Pasteur-CERBA. Durant cette année, l'infection a été confirmée chez 103 patients sur 3103 demandes (3,3%). L'infection est rapportée le plus fréquemment (33%) au retour des Antilles/Guyane, puis d'Asie (27%), d'Afrique (21%) et d'Amérique Centrale et du Sud (17%). Sur le plan clinique, un seul cas de dengue hémorragique a été rapporté. Par contre, 6 patients ont présenté une atteinte neurologique sévère, 3 patients un syndrome hémorragique sévère et 5 patients une infection surajoutée. Une patiente drépanocytaire homozygote a présenté une crise vaso-occlusive lors de l'infection avec complications majeures.

Nous avons mis en place un projet sur la dengue d'importation en Europe, dans le cadre de l'ENIVD afin d'évaluer l'incidence annuelle et la répartition géographique de la dengue d'importation en Europe, standardiser les techniques de diagnostic, et déterminer les aspects cliniques, épidémiologiques et virologiques des cas de dengue importés. Une première réunion des différents partenaires a eu lieu à l'Institut Pasteur à Paris en décembre 2001.

Un projet sur le diagnostic clinique et biologique précoce des formes sévères de la dengue a été mis en place en collaboration avec le Research Center for Emerging Viral Diseases, IRD-Université de Mahidol (Bangkok) et des médecins des hôpitaux de province au sud de Bangkok en Thaïlande.

(Collaborations : JD. Poveda, JP. Gonzalez, X. Deparis, J. Groen)

3. Prédiction et prévention de la fièvre hémorragique avec syndrome rénal (FHSR) (H. Zeller, D. Coudrier, B. Murgue)

Le diagnostic de FHSR est assuré en France par le CNR des Arbovirus et des Fièvres Hémorragiques Virales, ce qui permet d'avoir une image exhaustive de la situation épidémiologique. Le campagnol roussâtre, Clethrionomys glareolus, est le rongeur réservoir du virus Puumala. La presque totalité des infections humaines sont rencontrées dans la partie nord-est du pays. Des flambées épidémiques de FHSR sont rapportées tous les 3 ans, la dernière ayant eu lieu en 1999 avec 115 cas. Un plan d'action a été mis en place en octobre 2001 avec la participation de la CIRE-Est pour renforcer le système de surveillance basé sur la collecte des données épidémiologiques. Le renforcement des actions de sensibilisation des cliniciens est en cours, en vue de la prochaine épidémie annoncée pour 2002.

Du 1er janvier au 15 décembre 2001, le CNR a diagnostiqué 83 cas de FHSR. La répartition mensuelle des cas est assez homogène (5 à 8 cas) avec cependant un pic en janvier (11 cas) et octobre (14 cas). Ces résultats sont assez surprenants puisque l'année 2001 correspond à une période inter-épidémique (précédente flambée en 1999 et prochaine flambée prévue en 2002) avec habituellement moins de 40 cas/an. Cependant déjà au cours de l'année 2000, le CNR avait diagnostiqué 68 cas de FHSR. Il semble que l'on assiste à des modifications de la transmission du virus Puumala et les études au niveau du rongeur devraient permettre une meilleure compréhension de ce phénomène.

En mars 2001, le CNR a diagnostiqué le premier cas d'importation en Europe de Syndrome Pulmonaire à Hantavirus.

Une étude comparative de kits sérologiques pour le diagnostic des hantavirus a été réalisée, l'analyse des résultats en cours.

(Principales collaborations : M. Artois, P. Rollin)



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