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  Biodev


  Responsable : Jean-François NICOLAS (jfnicola@pasteur.fr)


  resume

 

Une opération importante de l'embryogenèse consiste à organiser la répartition des cellules en territoires. Nous étudions cet aspect du développement par l'analyse clonale de souris mosaïques LaacZ/LacZ. L'examen de clones dans le système nerveux central et dans le système musculaire nous a permis de décrire les patterns clonaux et de saisir certains des liens existant avec le patterning génétique dans l'élaboration du plan de formation de l'organisme.

L'expression génique est contrôlée au cours du développement par des facteurs transcriptionnels agissant en trans et par des modifications stables apposées en cis sur l'ADN. L'exploitation de gènes rapporteurs LacZ modifiés dans leur contenu en dinucléotides CpG, cibles des ADN méthyltransférases, nous permet d'étudier l'impact de certaines des modifications apposées en cis sur l'ADN à des moments clés du développement.



  rapport

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Patterning clonal et patterning génétique au cours de l'embryogenèse de la souris

Au cours de l'embryogenèse, l'état des cellules change constamment. A un temps donné, l'état d'une cellule dépend de l'intégration des signaux développementaux extrinsèques et intrinsèques auxquels ont été soumises les cellules dont elle est dérivée (ses ancestres). Comme ces signaux sont spatio-temporellement restreints, l'état d'une cellule donnée dépend des différentes positions que ses ancestres ont occupées au cours du développement. C'est pourquoi une opération importante de l'embryogenèse consiste à organiser la répartition des cellules, souvent en formant des territoires morphologiques reconnaissables. C'est vraisemblablement par ce biais que l'embryon coordonne morphogenèse et épigenèse.

Depuis quelque temps déjà, nous étudions l'organisation des cellules dans l'embryon de la souris en utilisant une méthode génétique d'analyse clonale qui permet de marquer les cellules de manière aléatoire au cours du développement (Fig1) . Cette méthode assure d'avoir des clones représentent toutes les cellules ancestrales d'une structure donnée. L'analyse peut être focalisée sur une structure particulière en employant des promoteurs spécifiques sans perdre la possibilité d'observer des événements cellulaires très précoces.

Cette année, le ciblage des clones dans le système nerveux central (SNC) analysés à E12,5 d'une part et dans le système musculaire à E11,5 nous a permis d'aborder le problème de la mise en place des territoires de l'embryon au cours de son élongation (axiogenèse). La comparaison de clones précoces dans ces deux systèmes a permis de mettre en évidence trois périodes d'organisation : une dispersion antéro-postérieure (AP) des précurseurs, l'arrêt de cette dispersion, puis une organisation médio-latérale (ML). L'organisation clonale de l'embryon traite donc successivement et d'une manière en partie indépendante des axes AP et ML.

L'examen comparatif des clones qui récapitulent l'historique de l'organisation des deux systèmes a permis de préciser les modes d'organisation clonale.

Pour le SNC, le pattern de clones indique qu'après une organisation en un pool unique dont les cellules participent à l'ensemble de la structure, ce pool se régionalise ; une partie produit les structures antérieures et l'autre les structures postérieures du SNC. A cette régionalisation sont associés des modes d'organisation clonaux différents. Les structures antérieures sont produites selon un mode régional. Au final à E12,5, les relations spatiales entre cellules sont donc clonales et la diversité clonale entre régions est importante. Les structures postérieure sont produites selon un mode temporel à partir de deux pools de cellules à capacité d'auto-renouvellement qui construit l'axe AP d'avant en arrière (Figure 2). Au final à E12,5, les relations spatiales entre cellules sont donc temporelles et non clonales et la diversité clonale entre régions est très faible.

Pour le système musculaire, on observe aussi une régionalisation précoce entre les parties antérieure (la tête) et postérieure (le tronc). La partie postérieure s'organise selon un mode temporel à partir d'un pool unique de cellules à capacité d'auto-renouvellement qui génère de façon synchrone les contributions droite et gauche de l'embryon. L'analyse poussée de l'organisation cellulaire montre que ce système de production de territoires génère d'abord une structure relativement statique (le mésoderme paraxial non segmenté) à partir duquel sont produits les somites (Figure 3).

Pour à la fois le SNC et le système musculaire, l'organisation clonale dans les territoires embryonnaires préfigure en grande partie l'organisation clonale de l'organisme.

Plusieurs conclusions importantes ont été déduites de ces informations :

  1. Patterning clonal et patterning génétique vont de pair.

  2. A des systèmes de patternings génétiques différents (pour l'avant et l'arrière de l'embryon) sont associés des modes de patternings clonaux différents (régional versus temporel).

  3. Les territoires de l'embryon immédiatement postérieurs au centre organisateur (le " nœud ") sont constitués de cellules à capacité d'auto-renouvellement, qu'ils produisent le SNC ou le mésoderme paraxial. Cette région de l'embryon au stade gastrula est donc très particulière.

  4. Les propriétés des cellules des territoires produisant le mésoderme paraxial et de celui-ci sont celles exigées à la fois par les systèmes très élaborés de spécification génétique (par les gènes Hox) et de segmentation (par une horloge moléculaire et un front de détermination). C'est là un extraordinaire exemple de coordination entre production de cellules, formation de territoires et leur patterning génétique. L'histoire phylogénétique de cette coordination permettra de savoir si elle constitue une contrainte pour les éléments du stade phylotypique des chordés.

  5. Le maintien chez l'adulte de l'organisation de l'embryon au stade phylotypique est une indication de l'importance cruciale de ce stade.

Modification épigénétique de l'ADN au cours du développement : impact sur l'expression

Notre approche expérimentale consiste à comparer dans des lignées de souris transgéniques l'expression de gènes rapporteurs appauvris en CpG. Ainsi, à partir de la molécule LacZ contenant 291 CpG, les molécules LagZ contenant 52 sites CpG et LagoZ n'en contenant que 2, ont été construites. Combiné à E1Fa, un promoteur sans spécificité tissulaire, ces trois transgènes ont été introduits dans le génome de la souris. L'analyse de leur patron d'expression a montré que dans des cellules somatiques à partir d'un certain seuil, la présence de CpG est fortement répressive. Par contre, elle l'est peu dans des cellules germinales. Curieusement, une expression différentielle selon l'origine parentale est observée dans les premiers stades du développement de la souris mais seulement avec certaines des combinaisons mises en jeu. Comme entre ces constructions, seule la partie codante du gène diffère, c'est la base moléculaire de la répression génique que nous voulons comprendre. La comparaison des états de méthylation des transgènes (gène rapporteur et promoteur E1Fa) en liaison avec leur expression et à différents stades du développement devrait nous permettre de trancher entre diverses hypothèses, toutes également plausibles actuellement.

Légendes des photos :

Figure 1 :

Système LaacZ de marquage des clones. A) Le gène rapporteur nls LaacZ. Un gène rapporteur nls LaacZ dans lequel une duplication a rendu l'enzyme inactive est lié à un promoteur musculaire spécifique, spécifique, MSP. Une recombinaison homologue spontanée entre les séquences dupliquées " aa " réétablit la structure b-galactosidase codante. B) Production de clones dans la progénie d'un croisement entre un mâle transgénique LaacZ et une femelle de type sauvage. Pendant le développement, une recombinaison homologue spontanée se produit entre les séquences dupliquées de LaacZ créant de ce fait un gène fonctionnel LacZ dans la cellule. Cet événement amorce le marquage clonal (coloration en bleu) dans l'embryon. Dans la lignée transgénique a-2, la fréquence des clones myogéniques b-gal+ à E11.5 est de 5x10-2 par embryon.

Figure 2 :

Un modèle des événements cellulaires durant le développement du tube neural. Le modèle concerne l'organisation des territoires et les mouvements cellulaires globaux ainsi que le développement des lignages cellulaires individuels. Avant le début de la gastrulation (E6), le pool des fondateurs du SNC (en vert) n'est pas régionalisé et en raison d'un important mélange cellulaire avant la gastrulation et pendant l'élongation de la plaque neurale (E5-E7), les précurseurs individuels produisent des descendants distribués tout le long de l'axe neural. A partir du début de la gastrulation (E7), les clones individuels ont une plus faible probabilité de produire des descendant à la fois dans la partie antérieure et dans la partie postérieur du SNC en raison de l'orientation postérieure des mouvements du groupe de cellules à capacité d'auto-renouvellement et de la croissance cohérente dans la partie antérieure du SNC. En conséquence, les groupes de précurseurs de la moelle épinière (en bleu) et du cerveau (en rouge et jaune) se séparent (régionalisation précoce). Un important mélange cellulaire se poursuit alors (E7-E8) dans le primordium de la moelle épinière en raison de la régression antéro-postérieure du pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement. Par contre, en raison de la croissance cohérente dans la plaque neurale antérieure, l'ordre AP des précurseurs est rapidement établi, conduisant à une régionalisation précoce des territoires du cerveau (gradient rouge à jaune). Après E8, le mélange cellulaire AP dans le cerveau et la partie antérieure de la moelle épinière est plus limité et suivi par une phase de dispersion dorso-ventrale des cellules.

Figure 3 :

Modèle d'organisation du pool de précurseurs du myotome dans la ligne primitive. La partie postérieure est en haut ; la partie antérieure est en bas. La ligne primitive (PS) : le mésoderme présomitique (PSM) et les somites (S), puis le dermomyotome (D) et le myotome (M) sont représentés indépendamment des structures adjacentes. Le pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement impliqué dans l'axiogenèse est localisé dans la ligne primitive. Le gradient de couleurs représente la régionalisation antéro-postérieure. Les cellules les plus antérieures (cercles noirs) contribuent à la partie intermédiaire du mésoderme paraxial, du mésoderme présomitique au dermomyotome et au myotome (flèches noires). Les cellules plus postérieures (cercles ouverts) contribuent à la partie plus latérale du mésoderme paraxial (flèches blanches). Cela aboutit à une réorientation de l'axe d'AP à ML, symbolisé par le changement d'orientation du gradient. La persistance de la régionalisation établie dans la ligne primitive jusqu'à la formation du dermomyotome et du myotome est schématisée par la continuité du gradient dans ces structures. Noter la symétrie du gradient entre les parties gauche et droite du mésoderme paraxial. Les cellules intermédiaires dans le pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement (cercles noirs et ouverts) contribuent bilatéralement au mésoderme paraxial (flèches noire et blanche) et les cellules les plus latérales (cercle gris) contribuent uniquement au côté où elles sont localisées (flèche grise). La séparation clonale entre les parties médiale et latérale des somites (lignes verticales épaisses) qui persiste dans le myotome est surimposée à la régionalisation médiolatérale du mésoderme paraxial établi dans le pool de cellules à capacité d'auto-renouvellement dans la ligne primitive. A, antérieur ; P, postérieur ; l, latéral ; m, médial ; PS, ligne primitive ; PSM, mésoderme présomitique ; S, somite ; D, dermomyotome ; M, myotome.



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FORLANI Sylvie, stagiaire post-doctorale

ELOY-TRINQUET Sophie, stagiaire de Doctorat

SIEUR Johan, stagiaire de Doctorat

TEICHERT Arnaud, stagiaire de DEA

LEGUE Emilie, stagiaire de DEA

ROSZKO Isabelle, stagiaire de DEA

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MARIETTE Christine (technicienne supérieure de laboratoire), IP, mariette@pasteur.fr

CAPGRAS Suzanne (technicienne de laboratoire), IP, scapgras@pasteur.fr

DARDENNE Pascal (technicien animalier), IP, dardenne@pasteur.fr

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