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  Responsable : BABINET Charles (chbabi@pasteur.fr)


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Notre laboratoire s'intéresse au développement embryonnaire de la souris. Trois voies de recherche sont poursuivies : 1) Le rôle des interactions nucléocytoplasmiques dans le développement préimplantatoire. 2) L'analyse de la fonction de certains gènes par mutagenèse dirigée in vivo et la recherche de gènes de développement grâce à la stratégie de piégeage de gènes dans les cellules ES. 3) La mise au point de stratégies plus efficaces de mutagenèse par recombinaison homologue (RH).



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1. Clonage de la mutation Ovum mutant, entraînant la mort embryonnaire au stade blastocyste et dont l'expression dépend d'un effet parental (P. Baldacci, M. Cohen-Tannoudji)

La lignée DDK est porteuse d'une mutation létale conditionnelle, Ovum mutant, qui entraîne la mort des embryons au stade blastocyste et dépend d'un effet parental (syndrome DDK). Nous avons montré que le syndrome DDK a son origine dans une interaction entre un facteur cytoplasmique DDK contenu dans le zygote et le génome paternel étranger. Nous avons maintenant établi un contig complet de la région génétique contenant le locus Om à l'aide de chromosomes artificiels de levure et de bactéries. Les techniques de piégeage d'exons et d'hybridation/sélection de cDNA associés au séquençage de la région Om (collaboration avec le Centre National de Séquençage, Evry) nous ont permis d'identifier environ une cinquantaine de gènes. Deux d'entre eux apparaissent comme des candidats privilégiés pour jouer un rôle dans le syndrome DDK : en effet d'une part, ils sont exprimés dans l'ovocyte dont nous savons par des expériences antérieures qu'ils contiennent un facteur impliqué dans la mort des embryons ; d'autre part ces gènes portent une mutation dans la lignée DDK et uniquement dans celle-ci parmi une quinzaine de lignées de souris de laboratoire sauvages.

2. Analyse de la fonction des gènes par mutagenèse dirigée in vivo et recherche de gènes impliqués dans le développement par piégeage de gènes

- Fonctions du gène HNF1b (J. Barra en collaboration avec le laboratoire de M. Yaniv, Institut Pasteur)

Nous avions montré que des embryons homozygotes pour une mutation nulle du gène HNF1b meurent aux alentours du jour 7 de la gestation et qu'un défaut de différenciation de l'endoderme viscéral en était la cause primaire. Nous avons poursuivi l'analyse par mutagenèse conditionnelle de la fonction du gène HNF1 b. Nous avons montré que l'absence de HNF1b dans les hépatocytes et les canaux biliaires entraîne l'absence de formation de canaux biliaires intrahépatiques et de la vésicule biliaire. Nous avons de plus identifié deux gènes qui jouent un rôle respectivement dans l'homéostasie biliaire et dans l'oxydation des acides gras et dont l'expression est éteinte en l'absence de HNF1b. Nous avons étendu nos observations sur l'inactivation spécifique de HNF1b dans l'épiblaste qui entraîne des défauts dans la morphogenèse du foie, du pancréas et du rein. De plus, des résultats préliminaires indiquent que l'inactivation de HNF1b dans l'intestin primitif entraîne d'importants défauts dans le développement de l'intestin.

- Piégeage de gènes dans les cellules ES (J. Barra)

Cette approche a pour but la création de mutations dans des gènes actifs au cours du développement de l'embryon de souris, en vue de leur caractérisation et de l'étude de leur fonction. Ces mutations sont obtenues par l'insertion, dans le génome des cellules ES, d'un vecteur qui comprend un gène rapporteur (qui code la beta-galactosidase et une protéine de résistance à un antibiotique), dépourvu de promoteur et de séquences régulatrices. Ce rapporteur ne s'exprime donc que s'il est inséré en phase dans un gène actif dans les cellules ES. Nous avons poursuivi cette année l'analyse d'une mutation dûe à l'insertion du piège à gène dans le gène TRAPa qui code pour une sous-unité d'un complexe protéique associé au translocon. L'insertion dans le gène TRAPa entraîne une létalité embryonnaire vers le jour 14 de développement. Nous avons démontré que les embryons souffraient d'un défaut de morphogenèse du coeur : en effet, celui-ci est hypertrophié et, de plus, présente un grave défaut de septation, entraînant une communication inter-ventriculaire.

3. Une approche en vue d'améliorer l'efficacité du ciblage génique (M. Cohen-Tannoudji)

Nous avons récemment mis au point une stratégie de modification du génome de la souris basée sur la stimulation des processus endogènes de réparation qui permet d'augmenter considérablement la fréquence de mutation par ciblage de gène dans un locus donné. Elle consiste à introduire dans le locus à cibler un site de reconnaissance de la méganucléase I-SceI. L'action de la méganucléase crée une cassure double brin qui stimule la recombinaison au locus avec une matrice de réparation. Sur la base de cette stratégie, nous cherchons à: i) perfectionner les méthodes de mutagenèse dirigée en introduisant des modifications programmées directement dans le génome du zygote sans passer par les cellules souches embryonnaires de souris. ii) réaliser des modifications génétiques ciblées dans des cellules somatiques grâce à cette méthodologie. iii) identifier un ou plusieurs sites permissifs pour l'expression ciblée de gènes impliqués dans le développement d'une pathologie ou d'agents thérapeutiques dans le cadre d'études de faisabilité de thérapie génique.

Dernièrement, nous avons développé un gène rapporteur, constitué de deux fragments du gène lacZ, interrompu par un site I-SceI. Le gène rapporteur n'est pas fonctionnel car il existe une région dupliquée de part et d'autre du site I-SceI. En coinjectant ce gène rapporteur avec une solution contenant la protéine I-SceI dans le pronucléus d'un oeuf fécondé, nous avons pu observer l'expression de la b-galactosidase dans un pourcentage significatif d'embryons. Nous cherchons par ailleurs à étendre ce résultat, qui témoigne d'une recombinaison extrachromosomique, au cas d'un gène rapporteur intégré dans le génome. Pour ce faire, des souris transgéniques pour le gène rapporteur, obtenues via les cellules ES, sont en cours de création. Nous pourrons alors injecter I-SceI dans les zygotes porteurs du transgène rapporteur et ainsi éprouver la possibilité de stimuler, in ovo, une recombinaison intrachromosomique.

Activité de service (S. Rudinger)

L'unité a la responsabilité d'un service pour la création de souris transgéniques.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

FLEURANCE Isabelle (ifleur@pasteur.fr)

BABINET Charles, CNRS et IP, (DR1 et Pr, chbabi@pasteur.fr)

BALDACCI Patricia, IP, (CR, baldacci@pasteur.fr) BARRA Jacqueline, IP, (CR, barraja@pasteur.fr)

COHEN-TANNOUDJI Michel, CNRS, (CR1, m-cohen@pasteur.fr

ARTUS Jérôme, Stagiaire DEA

COUMAILLEAU Franck, Doctorant

LE BRAS Stéphanie, Doctorante

PEYRON Fabienne, équivalent à Ingénieur d'étude

KRESS Chantal (Ingénieur d'études, kerssova@pasteur.fr)

MESBAH Karim (Technicien supérieur de laboratoire, mesbahk@pasteur.fr)

RUDINGER Stéphanie (Technicienne supérieure de laboratoire, rudinger@pasteur.fr)

VANDORMAEL-POURNIN Sandrine (Technicienne supérieure de laboratoire, drinette@pasteur.fr)


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