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  Responsable : GUILLEN-AGHION, Nancy (nguillen@pasteur.fr)


  resume

 

L'amibe hématophage, Entamoeba histolytica est l'agent étiologique de l'amibiase, une maladie infectieuse intestinale responsable de 50 millions de cas cliniques et de près de 100 000 décès par an. Le parasite, résidant dans le colon est doué de motilité, il envahit et détruit l'épithélium intestinal humain. L'objectif général de notre projet de recherche est d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués d'une part dans le mouvement de E. histolytica, et d'autre part dans son interaction avec les cellules humaines ou avec la matrice extracellulaire.



  rapport

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Les remaniements du cytosquelette chez E. histolytica conduisent soit à la polarisation de l'amibe, qui possède alors un uroïde dans la partie postérieure et un pseudopode locomoteur dans la partie antérieure, soit à la formation de pseudopodes phagocytaires. La mise en place de ces appendices permet à E. histolytica de se déplacer et de phagocyter les cellules humaines. Nous espérons proposer un modèle intégré de signalisation allant de la perception par l'amibe de son environnement tissulaire, à la transduction des signaux mettant en route le remodelage du cytosquelette parasitaire nécessaire à la motilité, et/ou à l'interaction avec les cellules humaines et leur phagocytose.

1. Polarisation de E. histolytica pendant le mouvement et formation de pseudopodes.

E. Labruyère, G. Vogt en collaboration avec C. Zimmer et J.C. Olivo dans le PTR " Nouvelles approches pour l'étude de la polarisation moléculaire de cellules mobiles par analyse d'images quantitative " dirigé par A. Alcover.

L'analyse cellulaire, génétique et moléculaire de la polarisation des amibes et de la formation de pseudopodes a permis d'identifier plusieurs protéines régulatrices de l'activité du cytosquelette ; parmi elles, la kinase PAK connue pour son activité lors de changements morphologiques des cellules eucaryotes. A l'aide de souches exprimant différents domaines de PAK et d'une méthode d'analyse d'images quantitative mise au point dans ce projet, nous avons étudié les différents phénotypes des populations d'amibes sauvages ou de celles modifiées. Chez E. histolytica, PAK ne possède pas les domaines de régulation décrits pour ses homologues. Nous avons cependant montré que la région NH2-terminal de cette enzyme est le domaine régulateur qui lie la GTPase Rac et est essentielle pour la régulation de la dynamique du cytosquelette, de la polarisation de E. histolytica, de la motilité et du nombre de pseudopodes.

2. Dynamique du cytosquelette pendant la phagocytose chez E. histolytica

S. Marion en collaboration avec C. Laurent-Winter, (PT-Protéomique, IP), C. Whilem et F. Gazeau (Université Paris VI). Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV.

La phagocytose de cellules humaines est un phénomène majeur pendant l'amibiase. Elle est amorcée grâce aux récepteurs de surface amibiens qui reconnaissent des ligands localisés sur les cellules cibles, le signal déclenché active les remaniements du cytosquelette. Plusieurs protéines du cytosquelette participant à la formation des pseudopodes pendant la phagocytose ont déjà été identifiées dans notre laboratoire. En plus de l'actine, nous avons décrit ABP-120, la myosine IB et le complexe Arp2/3. Une souche qui surexprime le gène codant la myosine IB a été fabriquée et nous avons montré, par mesure de la viscoélasticité du cytoplasme, que son cytosquelette est plus dense, un fait qui corrèle avec la réduction du taux de phagocytose. Dans cette souche, la myosine IB forme des petits amas autour de la vacuole de phagocytose, alors que l'actine F forme des comètes qui sont également enrichies par le complexe Arp 2/3. L'analyse en électrophorèse bidimensionnelle de protéines isolées de phagosomes issus des souches sauvages ou MyoIB+ montre des différences qualitatives de la nature de complexes protéiques associés au phénotype MyoIB+.

3. Rôle de la motilité et de l'adhérence dans la mise en place de l'amibiase.

P. Tavares en collaboration avec M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie) et avec H. Khun, A. Cardona et M. Huerre (Unité Expertise Histotechnologie et Pathologie, IP).

Nous avons observé que la lectine Gal-GalNAc, un antigène immuno-dominant qui participe à l'adhérence des amibes aux cellules épithéliales, subit le capping et est enrichi dans des microdomaines lipidiques. L'analyse cellulaire, génétique et moléculaire des fonctions de la myosine II a montré qu'elle est essentielle pour la polarité, la motilité, le capping de récepteurs en particulier celui de la lectine Gal-GalNAc. La myosine II est enrichie dans le cytosquelette suite à l'interaction du parasite avec les entérocytes. Dans un modèle expérimental de l'amibiase, l'analyse de souches déficientes en myosine II ou dans la lectine Gal-GalNAc a dévoilé le rôle primordial de l'adhérence et du cytosquelette dans l'établissement de la virulence. La période allant de 6 à 12 heures d'infestation est déterminante pour que le parasite acquière les marqueurs nécessaires à sa survie et à son développement au sein tissulaire. Dès son arrivé dans le foie, E. histolytica induit l'apoptose de cellules endothéliales et la nécrose rapide des hépatocytes et de cellules de la réponse immune. Les souches diminuées en lectine Gal-GalNAc et en myosine II montrent, dans ce modèle, des phénotypes très différents et contrastés. Alors que la première envahie très rapidement le tissu et conduit à une " métastase " hépatique, la deuxième est totalement inhibée dans le processus pathogène. Les facteurs de régulation de ces phénotypes sont à l'étude.

4. Analyse cellulaire de la relation entérocyte-parasite dans le cas de l'amibiase.

N. Guillén, J. Mounier, M. Seigneur en collaboration avec E. Coudrier et F. Amblard (Institut Curie), avec M.-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie) et avec M.C. Prevost (PT-Microscopie Electronique IP). Projet soutenu par le MENRT à travers l'action "Programme de Recherche Fondamentale en Microbiologie et Maladies Infectieuses et Parasitaires "

L'adhérence et la motilité de E. histolytica sauvage et celle de souches déficientes en myosine II ou en lectine Gal-GalNAc, ont été analysées par microscopie électronique, confocale et biphotonique en temps réel. La souche sauvage se déplace à une vitesse d'un m/sec sur une surface neutre tel le verre et s'arrête rapidement à la rencontre de l'apex des entérocytes. La mise en place de mécanismes d'adhérence s'accompagne de changements drastiques au niveau du cytosquelette des cellules cibles. Les microfilaments sont délocalisés et des remaniements membranaires des entérocytes sont produits. Les amibes pénètrent par la suite dans la monocouche de cellules. La souche déficiente en Gal-GalNAc a un taux d'adhérence réduit à 40 % du sauvage, se déplace rapidement et " roule " sur l'apex des entérocytes. Bien que cytotoxique, cette souche a une capacité réduite pour pénétrer la monocouche de cellules. En revanche, les phénotypes de la souche altérée dans les fonctions de la myosine II montrent qu'elle ne se déplace pas, présente un mouvement " pendulaire " avec peu de points d'attache sur l'apex des cellules et en conséquence perd toute virulence. L'analyse approfondie de l'interaction amibe-entérocytes révèle qu'en dehors de la lectine Gal-GalNAc d'autres protéines se lient à l'apex des entérocytes. Deux de ces protéines ont été purifiées et leur étude moléculaire et cellulaire est en cours.

5. Régulation de gènes amibiens pendant l'invasion tissulaire.

C. Weber en collaboration avec C. Bouchier (PT-Génomique, IP), et D. Mirelman (Institut Weizmann, Israel).

Pour identifier les gènes spécifiquement activés lors de la mise en route de l'invasion des tissus par E. histolytica, l'analyse de transcrits amibiens par une approche " transcriptome " a été démarrée. Une banque de cDNA a été construite et les clones, en cours de séquençage, serviront à la fabrication de puces à ADN. Des banques soustractives d'ARN messagers des amibes sauvages ou déficientes en lectine Gal-GalNAc sont en cours de construction, elles permettront le criblage de ces puces.

Légende

Localisation de PAK et de la F-actine chez Entamoeba histolytica

Chez une amibe en mouvement, allant sur cette micrographie de la gauche vers la droite, un pseudopode prédominant (visible au DIC, Differential Interference Contrast) se forme au front de migration et dirige sa locomotion. La micrographie obtenue après marquage en immunofluorescence et analyse en microscopie confocale montre que l'actine filamenteuse (vert) est présente dans le cytoplasme et dans le pseudopode et est enrichie au pôle postérieur de l'amibe. PAK (rouge) est dispersé dans le cytoplasme et est concentré au niveau du pseudopode. La superposition des deux marquages indique que la F-actine et PAK se concentrent dans deux sites opposés contribuant ainsi à la polarisation de E. histolytica lors de la migration. Echelle, 5 µm



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Lambrecht, Marie-Régine, lambrech@pasteur.fr

Guillén-Aghion, Nancy. Directeur de Recherche CNRS. nguillen@pasteur.fr

Labruyère-Dadaglio, Elisabeth. Chargée de Recherche, I.P.

Seigneur, Marie. Chargée de Recherche, INRA.

Vayssié-Niger, Laurence. Post-Doctorant EU.

Marion, Sabrina. Etudiante en thèse de Doctorat.

Vogt, Guillaume. Etudiant D.E.A.

Weber, Christian. Technicien, I.P.

Lambrecht, Marie-Régine, Secrétaire, I.P.


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