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  Responsable : Michel GOLDBERG (goldberg@pasteur.fr)


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L'Unité combine la physico-chimie, la biochimie, la génétique, l'ingénierie et la modélisation des protéines pour étudier divers problèmes liés à leur structure et à leur intégration dans plusieurs fonctions cellulaires: l'acquisition de leur structure fonctionnelle in vitro et in vivo, les aspects énergétiques de leurs interactions, l'origine atomique de leur stabilité et de leur spécificité fonctionnelle, l'utilisation comme agents vaccinants de protéines modifiées par "greffage" de peptides artificiels et l'utilisation de protéines modifiées dans diverses applications biotechnologiques



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Les travaux de l'Unité sont centrés sur deux thèmes principaux: les mécanismes par lesquels les protéines adoptent la structure repliée qui leur confère leur fonction biologique, et l'ingénierie des protéines appliquée à divers problèmes fondamentaux ou du domaine des biotechnologies.

I- REPLIEMENT DES PROTÉINES IN VITRO (Michel Goldberg)

Ces recherches portent sur la connaissance, au niveau fondamental, des mécanismes qui permettent à une protéine d'acquérir en quelques secondes la structure tridimensionnelle complexe, dite "native", qui lui confère ses propriétés biologiques. Les connaissances ainsi acquises sont utilisées pour améliorer la structuration de protéines, en particulier dans des processus industriels liés aux biotechnologies.

a- Etude des intermédiaires précoces de repliement (Michel Goldberg, Valérie Guez, Nicole Jarrett et Alain Chaffotte)

Nous avons poursuivi l'étude du couplage entre la formation d'interactions à longue portée (les ponts disulfures) et l'apparition de structures locales (les alpha-hélices et les brins beta de la structure secondaire) lors des étapes précoces du repliement d'une protéine modèle, le lysozyme de poule. Partant de l'observation que la structure secondaire du lysozyme se forme très rapidement lorsque les 4 ponts disulfures sont préformés, alors qu'elle n'apparaît pas en leur absence, nous avons cherché à identifier ceux des ponts disulfures qui sont essentiels à la formation très rapide de la structure secondaire. Pour cela, nous avions construit au cours des années précédentes 4 doubles mutants dans chacun desquels les 2 cystéines engagées dans l'un des 4 ponts S-S avaient été remplacées par 2 alanines.

L'effet de la suppression de chacun de ces pont S-S individuellement a désormais été caractérisé par une série de critères spectroscopiques, hydrodynamiques et fonctionnels qui ont permis de confirmer la très grande similarité structurale des protéines "naturelle" (avec 4 ponts disulfures) et "mutante" (avec 3 ponts disulfures). Les différentes phases de leur repliement ont été étudiées en utilisant un mélangeur rapide qui permet de déclencher le repliement en moins de 4 millièmes de secondes. Au cours de l'année écoulée, nous avons achevé l'étude du mutant dans lequel le pont S-S entre les cystéines 64 et 80 est absent. Nous avons ainsi pu démontrer que la suppression de ce pont disulfure n'empêche pas la formation très rapide (en moins de 4 millisecondes) de la structure secondaire. Le même résultat avait été obtenu avec chacun des 3 autres ponts S-S. Au contraire du pont S-S entre les aminoacides 30 et 115, ou de celui entre les aminoacides 6 et 127, mais comme c'était le cas pour celui entre les aminoacides 76 et 94, la suppression du pont disulfure 64-80 n'empêche pas la formation d'une espèce partiellement structurée qui ralentit le repliement de la protéine naturelle. Cependant, au contraire du pont 76-94 qui déstabilise cet intermédiaire dans la protéine normale (à 4 ponts disulfures), le pont 64-80 stabilise l'intermédiaire. La présence de ce pont disulfure (64-80) est donc responsable de la phase cinétiquement limitante dans le repliement de la protéine normale. Ces observations constituent un ensemble de preuves expérimentales solides en faveur du modèle du "paysage énergétique" récemment proposé par les théoriciens pour expliquer le repliement rapide des protéines.

Pour mieux comprendre le couplage entre ponts disulfures et acquisition de la structure tridimensionnelle de la chaîne polypeptidique nous avons cherché à comparer, lors du repliement oxydatif du lysozyme réduit, la cinétique de formation des ponts disulfures à celle d'apparition de motifs antigéniques qui ne peuvent être reconnus par un anticorps monoclonal que si la protéine est (au moins localement) correctement repliée (voir figure 1).

Deux motifs antigéniques, présents sur deux faces opposées de la molécule repliée et dépendant du repliement de deux régions topologiquement distinctes de la chaîne polypeptidique ont été étudiés. Les cinétiques d'apparition de leur antigénicité vis-à-vis des deux anticorps monoclonaux correspondants ont pu être observées grâce à une technique d'immunomarquage pulsé mise au point au laboratoire. Elles correspondent assez bien aux cinétiques d'apparition des espèces à deux ponts S-S pour l'un des motifs, et à trois S-S pour l'autre. La caractérisation des ponts concernés est en cours (collaboration avec M. Ruoppolo - Université de Salerne).

b- Production et étude d'une protéine recombinante, candidat vaccin contre le paludisme (Alain Chaffotte et Anne-Gaëlle Planson)

Le fragment C-terminal F19 de la protéine MSP1 (Merozoite Surface Protein) de Plasmodium falciparum, un candidat vaccin contre le paludisme, a été produit dans l'espace périplasmique de E. coli sous la forme d'une protéine de fusion avec Mal E (Protéine affine du maltose de E. coli). L'insertion d'un site de clivage spécifique du facteur Xa a permis d'isoler le fragment F19. Après purification, le spectre d'absorption ultraviolette du fragment confirme la présence de ponts disulfures. Le fragment n'est pas agrégé par formation de ponts disulfures inter-chaîne. Une étude préliminaire du fragment ainsi produit a montré qu'il possède des caractéristiques structurales similaires à celles du fragment homologue originellement produit dans des cellules d'insecte. Les deux fragments réagissent de façon comparable avec plusieurs anticorps monoclonaux. La comparaison des spectres de RMN bidimensionnelle TOCSY et NOESY des protéines produites chez E. coli et dans des cellules d'insectes a révélé des résonances communes dans la région spectrale caractéristique des structures b. Ce résultat suggère que le fragment F19 produit à partir de E. coli possède la même organisation topologique (2 domaines EGF) que celle du fragment homologue produit à partir de cellules d'insecte, établie par cristallographie aux rayons X. La comparaison des caractéristiques structurales des 2 fragments est actuellement poursuivie. Elle comporte en particulier la détermination des constantes d'affinité vis-à-vis de plusieurs anticorps monoclonaux.

c- Cinétique d'association-dissociation et de repliement de la DHFR R67 (Christophe Bodenreider et Annick Méjean)

Notre étude sur les aspects cinétiques de l'équilibre dimères-tétramères au sein de la DHFR R67 nous avait conduits à proposer un modèle original permettant en particulier de rendre compte de l'effet du pH sur cet équilibre. L'association de dimères en tétramères et les évènements moléculaires qui y sont associés peuvent être considérés comme les dernières étapes du repliement de cette protéine. Dans le but d'identifier les évènements moléculaires responsables de l'initiation du repliement de la DHFR R67, nous cherchons à savoir si l'assemblage de deux monomères désordonnés précède le repliement des monomères, ou si au contraire les monomères doivent d'abord se replier pour pouvoir se reconnaître et s'assembler en dimères. Pour cela, nous avons abordé l'étude de la cinétique de renaturation de la DHFR R67 à pH 5, où elle se renature sous forme de dimères stables. En observant les cinétiques de regain des propriétés spectrales de la protéine (dichroïsme circulaire dans l'ultra-violet lointain, fluorescence de la protéine), nous avons pu identifier trois phases. L'une, extrêmement rapide, est achevée en moins de 4 millisecondes. Une deuxième, rapide, a une demi-vie de l'ordre d'une demi-seconde. La dernière, beaucoup plus lente, a une demi-vie de l'ordre de 30 secondes. Nous avons supposé qu'elle pouvait correspondre à l'isomérisation cis-trans de résidus de proline.

Cela a été confirmé par des expériences de double-saut ainsi que par l'accélération spécifique de cette phase par la présence d'une prolyl-isomérase dans le tampon de renaturation. L'observation des cinétiques à différentes concentrations de protéine ainsi que des cinétiques suivies par transfert d'énergie entre un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur (greffés sur des monomères dénaturés) indiquait que la phase d'association (donc concentration-dépendante) correspondait à la deuxième phase. Une collaboration avec Nicolas Kellershohn (Université d'Orsay) et l'utilisation de logiciel permettant d'ajuster cinétiquement une succession de réactions de premier ordre et de second ordre nous ont permis une caractérisation précise et complète de tout le processus de repliement de la DHFR R67. Une partie de la structure secondaire est très rapidement acquise au sein du monomère (k>500 s-1). Un réajustement tertiaire ultérieur du monomère (k=30 s-1) est alors suivi par l'association (k=106 M-1.s-1) qu'accompagne l'achèvement de la structure secondaire. Nous avons de plus montré que 15% des molécules suivent une chemin de repliement lent, dont la constante de vitesse (k=0,04 s-1) est contrôlée par l'isomérisation de prolines.

II- Contrôle du repliement des protéines de l'enveloppe bactérienne (Jean-Michel Betton, Nathalie Sassoon, Jean-Philippe Arié, Sabine Hunke, Mireille Hervé, Nathalie Berger et Denis Phichith)

Afin de comprendre les mécanismes de reconnaissance et de régulation cellulaires liés à la présence de protéines d'enveloppe anormales, nous utilisons l'expression d'un mutant d'une protéine périplasmique modèle, la protéine affine du maltose ou MalE31, dont le repliement défectueux conduit à l'accumulation d'espèces protéiques incorrectement repliées qui s'agrègent et forment des corps d'inclusion. L'effet de la température sur la croissance des bactéries surexprimant malE31 est activement étudié car nous avons observé que si aucun phénomène d'interférence ou d'inhibition de l'exportation, lié à la surproduction de ce variant, n'était détecté à 30°C, un phénotype thermo-sensible (et létal) pouvait s'observer à 37°C, mais pas à 42°C. A partir de ces observations, nous avons initié deux approches complémentaires afin de caractériser la réponse spécifique à ce stress extracytoplasmique: (i) une analyse des profils d'expression à l'aide de membranes de nylon contenant, sous forme de produits PCR, tous les cadres de lecture ouvertes du génome d'E. coli. Nous comparons les pools d'ARN messagers préparés à partir d'uns souche surproduisant MalE31 ou MalE sauvage, à 30°C et 37°C. (ii) une recherche des suppresseurs du phénotype toxique lié à l'agrégation massive de MalE31 dans le périplasme à 37°C. Une banque de gènes d'E. coli a été construite en clonant des fragments d'ADN dans un vecteur d'expression multicopie. Puis, nous sélectionnerons ou criblerons les clones capables de restaurer la croissance de la souche surproduisant MalE31.

D'autre part, nous étudions les relations structure-fonction des deux protéines périplasmiques de choc thermique FkpA et DegP qui contrôlent le repliement et l'assemblage des protéines de l'enveloppe bactérienne. Pour FkpA, nous avons mis en évidence que son activité chaperon, indépendante de son activité PPIase, était capable de prévenir l'agrégation périplasmique de MalE31. Pour DegP, nous étudions l'organisation structurale de cette protéase hexamérique afin de comprendre les mécanismes qui lui permette la reconnaissance spécifique des protéines incorrectement repliées. Pour cela, nous cherchons à déterminer le rôle respectif des deux domaines PDZ, qui forment la partie C-terminale de cette protéase, dans les processus d'assemblage fonctionnel et de fixation des substrats. Une analyse par délétion a permis la définition d'un domaine minimal capable de complémenter une souche degP- pour la croissance bactérienne à hautes températures. En effet, le domaine PDZ2 serait impliqué dans une interface trimérique puisque sa délétion génère une protéase dimérique fonctionnelle.

Enfin, dans le cadre du programme de Génomique Structurale de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris le clonage à haut débit de 350 cibles de Mycobacterium tuberculosis. Les 50 premiers gènes ont été clonés avec succès dans un vecteur d'expression bactérien à l'aide d'une technique de clonage basée sur la recombinaison spécifique de site du phage lambda (Gateway). Dans le cadre de ce programme, nous sommes également intéressés par des systèmes alternatifs de production de protéines recombinantes. Le système de production in vitro, basé sur le couplage transcription-traduction à haut rendement (commercialisé par la Société Roche sur le nom de Rapid Translation System ou RTS), a retenu notre attention. En collaboration avec le laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules (Département BGM), nous avons testé la possibilité de marquer sélectivement les protéines, produites dans le système RTS, par certains acides aminés enrichis en carbone 13 et azote 15. Ce type de marquage spécifique d'un type d'acide aminé, qui est essentiel pour la préparation d'échantillons pour la spectroscopie RMN, est pratiquement impossible à réaliser dans la bactérie à cause du métabolisme des acides aminés. Nos résultats, obtenus à partir de notre protéine modèle, MalE, et de deux acides aminés, Asp et Arg, représentatifs du métabolisme bactérien, ont montré que tous ces résidus ont été quantitativement marqués sans redistribution des atomes lourds au niveau des autres résidus de la protéine. Actuellement, nous complétons ces expériences, qui suggèrent que le métabolisme des acides aminés dans le système RTS n'est pas fonctionnel, avec des nouveaux lysats bactériens capables de produire 5 mg de protéine par ml de réaction, et un ensemble plus complet de 9 acides aminés (Cys, Glu, Asp, Arg, His, Leu, Thr, Ser, et Gly).

 

III- MODÉLISATION moléculaire des énergies et processus d'assemblage des protéines (Arnaud Blondel et Roland Nageotte)

Nous poursuivons le développement des théories physiques décrivant les macromolécules biologiques avec les motivations suivantes:

- proposer des méthodes de modélisation des énergies d'association entre protéines qui soient suffisamment rapides et fiables pour représenter une alternative recevable à l'approche expérimentale. Les enjeux sont importants pour l'analyse des associations impliquées dans divers processus biologiques et/ou pour la conception de nouveaux agents thérapeutiques.

- être capables d'identifier les conformations pertinentes des systèmes macromoléculaires. Les applications peuvent être soit la recherche du mode d'association de molécules, protéines ou agents thérapeutiques, ou encore l'élucidation de mécanismes complexes comme le repliement des protéines.

Pour développer les méthodes de modélisation quantitative de l'énergie libre d'associations entre protéines nous avons choisi de mener simultanément l'étude expérimentale et théorique d'un système modèle, la dihydrofolate réductase DHFR R67.

Cette protéine de résistance à un antibiotique est formée par l'association de 4 sous-unités identiques. Nous avons construit par génie génétique des variants permettant de sonder l'importance des différents contacts entre sous-unités. L'association entre variants a été mise en évidence par un système de tests combinatoires développé au laboratoire. Le mécanisme des associations a été étudié grâce à des mesures en cinétique et à l'équilibre. L'énergie de ces associations a alors été déterminée par des méthodes physico-chimiques très précises également mises au point au laboratoire. Enfin, pour contrôler l'effet structural des modifications apportées à la protéine, nous avons cristallisé un certain nombre de variants sous forme isolée ou associée et entrepris le raffinement cristallographique de la structure atomique de ces molécules.

Parallèlement, afin de tester les méthodes théoriques, les énergies mises en jeux dans ces associations ont été calculées par modélisation. Cela a nécessité la conception et le développement d'une méthode de calcul des variations d'énergie libre permettant de réduire très significativement les incertitudes. Cette méthode a été étendue pour tenir compte des molécules d'eau baignant les protéines ainsi que des interactions électrostatiques à longue distance. Elle a été incorporée dans la version académique du programme informatique, CHARMM. L'implémentation en a été faite au laboratoire pour pouvoir utiliser des stations de travail Unix et des super-calculateurs massivement parallèles. Lors de la réalisation de ces calculs, la prise en compte des relaxations structurales consécutives aux mutations s'est imposée pour la précision des calculs. Un protocole de calcul a été mis au point pour cela. Par ailleurs, en effectuant des calculs redondants, nous avons pu montrer que notre méthode avait de bonnes propriétés de convergence (~0.4 kcal/mol par calcul). Enfin, l'accord avec les données expérimentales est bon (~0.4 kcal/mol de différence moyenne).

L'année 2000 avait apporté beaucoup de résultats. Un certains nombre de points ont été approfondis en 2001.

- Le modèle mathématique utilisé dans l'analyse des résultats expérimentaux pour déterminer l'affinité des complexes a été complété pour prendre en compte les réactions parasites éventuelles. L'importance relative maximum de ces réactions a été déterminée expérimentalement. La robustesse du modèle a été testée sur les données expérimentales.

- De nouveaux calculs ont été entrepris pour poursuivre la validation des méthodes théoriques sur d'autres types d'associations.

Ainsi, l'ensemble de ces travaux a fourni les résultats suivants:

- Un jeu de données expérimentales précises permettant de tester les prédictions d'interactions protéine-protéine: les effets de 15 types de modifications entre 6 types de complexes sont maintenant connus pour un mécanisme d'association bien précis.

- Les raffinements cristallographiques préliminaires montrent peu de changements structuraux dans les tétramères par rapport à la protéine sauvage.

- Il semble ainsi possible de prédire par modélisation, avec une précision comparable aux expériences, l'effet de mutations sur l'assemblage de protéines.

- Dans la mesure des calculs effectués, les champs de forces et méthodes de modélisation utilisés dans le programme CHARMM permettent de bien rendre compte de la physique des macromolécules biologiques, et semblent donc applicables à d'autres problèmes de modélisation.

Il nous paraît important de préciser qu'une série de calculs prend à ce jour de l'ordre de 2 mois sur station de travail, mais que sur les super-calculateurs de demain ( > 1 Tflops), ces mêmes calculs ne devraient prendre que 2-3 jours, c'est-à-dire bien moins que le temps requis pour obtenir le résultat par une approche expérimentale...

En partant du constat que les méthodes mises au point semblaient permettre de bien appréhender les interactions entre macromolécules biologiques de structures connues, nous nous sommes intéressés au problème de l'identification des conformations pertinentes lorsque celles-ci ne sont pas connues. Le champ d'application couvre la recherche du mode d'association de molécules, protéines ou agents thérapeutiques, ou l'élucidation de mécanismes complexes comme le repliement des protéines. La difficulté provient de la haute dimentionnalité des systèmes biologiques (trois paramètres de position par atome distinguable). Nous avons entamé notre réflexion en reprenant les travaux des années précédentes pour lesquels nous avions développé un algorithme d'exploration conformationnel. Cet algorithme utilisait une dynamique moléculaire accélérée pour générer des structures, puis celles-ci étaient "triées" en sous-ensembles par combinaison/groupage. Nous avons ainsi pu proposer la structure d'un complexe afin de mieux comprendre l'interaction et l'effet des mutations, ce qui montrait la puissance de la méthode.

IV- INGÉNIERIE DES PROTÉINES (Hugues Bedouelle)

Nos recherches sont focalisées sur les relations entre la structure tri-dimensionnelle des protéines, leur stabilité conformationnelle et leur mécanisme d'action. Nous utilisons l'approche multidisciplinaire de l'ingénierie des protéines, y compris l'évolution dirigée.

a- Construction d'immunocapteurs (Martial Renard, Laurent Belkadi, Hugues Bedouelle; en coll. avec D. Altschhuh (Strasbourg)

Nous développons une approche générale pour transformer un anticorps en biocapteur optique autonome. Le principe consiste à changer un résidu de l'anticorps, situé à la périphérie du site de fixation à l'antigène, en cystéine par mutagenèse dirigée, puis à coupler chimiquement un fluorophore à cette cystéine. Nous avons établi des règles de conception, basées sur la structure cristalline du complexe entre anticorps et antigène, pour choisir le site de couplage. Nous avons validé ces règles pour l'anticorps D1.3, dirigé contre le lysozyme de poule. Les résultats ont suggéré des règles de conception plus générales, qui s'appliqueraient à des anticorps de structure inconnue et qui sont en cours de validation. De tels immunocapteurs pourraient être utilisés sous forme de puces de protéines, pour le dosage d'antigènes.

b- Reconnaissance entre un anticorps neutralisant et le virus de la dengue (Laurent Belkadi, Patrick England et Hugues Bedouelle)

En collaboration avec le Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps, nous analysons le mécanisme de reconnaissance entre un anticorps monoclonal et les quatre sérotypes du virus de la dengue, dans le but d'améliorer son pouvoir protecteur. Dans une première étape, son épitope a été cartographié dans la protéine d'enveloppe du virus (en collaboration). Dans une deuxième étape, nous avons identifié les résidus de l'anticorps qui interviennent dans la reconnaissance de l'antigène, en les changeant en alanine. Les résidus de l'anticorps qui interviennent dans la reconnaissance du sérotype DEN2, constituent un sous-ensemble de ceux pour DEN1, leurs contributions énergétiques sont plus faibles, mais les résidus prépondérants sont les mêmes. Les mutations qui diminuent la vitesse d'association, correspondent à celles qui changent les classes canoniques de conformation des boucles hypervariables. Ces résultats aideront à cibler certains résidus de l'anticorps pour améliorer son affinité ou élargir sa spécificité par mutagenèse.

c- Structure d'une tyrosyl-ARNt synthétase eubactérienne (Valérie Guez et Hugues Bedouelle)

La tyrosyl-ARNt synthétase (TyrRS) participe à la traduction du code génétique in vivo, et constitue une cible potentielle pour des antibiotiques. Elle comprend trois domaines structuraux: un domaine alpha/bêta qui est caractéristique des aminoacyl-ARNt synthétases de classe I, un domaine alpha-hélical intermédiaire, et un domaine C-terminal (100 résidus) qui est désordonné dans la structure cristalline et essentiel pour la fixation du tRNA-Tyr. En collaboration avec l'Unité de RMN des Biomolécules, nous avons déterminé la structure tridimensionnelle du domaine C-terminal de la TyrRS de Bacillus stearothermophilus, ce qui a permis d'obtenir la première structure complète d'une TyrRS eubactérienne. Son repliement est similaire à ceux d'autres protéines fixatrices d'ARN, mais nouveau parmi les aminoacyl-ARNt synthétases.

 

V- Toxines recombinantes d'intérêt thérapeutique ou biotechnologique (Daniel Ladant)

Les travaux de l'équipe sont focalisés sur l'étude des relations structure/fonction d'une toxine bactérienne, la toxine adénylcyclase (AC) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Cette toxine est l'un des facteurs de virulence essentiels de cet organisme. Elle présente plusieurs propriétés particulièrement intéressantes d'un point de vue fondamental. L'adénylcyclase est sécrétée par B. pertussis et possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où, activée par la calmoduline (CaM), elle synthétise activement de l'AMP cyclique et ainsi altère le métabolisme cellulaire. L'AC est constituée d'un polypeptide de 1706 acides aminés : l'activité catalytique calmoduline-dépendante est localisée dans les 400 premiers acides aminés. La partie C-terminale de 1300 résidus environ est responsable de la liaison avec les cellules cibles et de la translocation du domaine catalytique N-terminal à travers la membrane cytoplasmique de ces cellules. Nos recherches actuelles recouvrent essentiellement deux aspects :

a- Etude des mécanismes d'entrée de la toxine AC dans les cellules cibles et applications à la vectorisation d'épitopes in vivo. (Cécile Bauche - Sakina Gmira - Gouzel Karimova et Daniel Ladant)

D'un point de vue fondamental, notre objectif est d'élucider les mécanismes moléculaires responsables de la translocation de la toxine AC dans les cellules cibles. Cette toxine possède en effet la propriété tout à fait originale de pouvoir délivrer son domaine catalytique N-terminal dans le cytoplasme des cellules cibles directement à travers la membrane plasmique de ces cellules. Ces travaux sont en fait étroitement combinés avec un objectif très finalisé, développé depuis plusieurs années en collaboration étroite avec C. Leclerc (Unité de Biologie des Régulations Immunitaires, Institut Pasteur), et qui consiste en l'ingénierie de toxines AC recombinantes d'intérêt vaccinal. Nous avons montré en effet que la toxine AC est capable de vectoriser des épitopes T CD8+ (c'est-à-dire associés aux complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I, CMH-I) dans les cellules présentatrices d'antigènes (cellules dendritiques) afin d'activer des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques. Nous avions établi l'an passé que la toxine AC utilise comme récepteur cellulaire l'intégrine aM/b2, qui est exprimée en particulier par les cellules dendritiques (ainsi que par quelques autres populations leucocytaires). La vectorisation sélective de la toxine AC sur les cellules dendritiques est très certainement à l'origine du remarquable pouvoir immunogène des toxines AC recombinantes. Nous nous efforçons actuellement d'identifier les sites d'interaction de la toxine AC avec l'intégrine aM/b2.Par ailleurs nous avons montré que des polypeptides comportant jusqu'à 190 acides aminés peuvent être insérés dans le domaine catalytique de la toxine AC sans que cela n'affecte sa translocation dans les cellules eucaryotes, ce qui illustre la remarquable tolérance fonctionnelle de la toxine AC. Nous avons depuis produit différentes toxines recombinantes portant de larges fragments d'antigènes dont les propriétés immunologiques sont actuellement analysées par l'équipe de C. Leclerc. Enfin nous avons validé une autre approche qui consiste à coupler chimiquement à la toxine AC des peptides correspondants à des épitopes T d'intérêt. Cette approche présente l'avantage d'offrir une plus grande flexibilité dans la construction de toxines recombinantes portant les peptides antigéniques désirés.

b- AC comme enzyme de signalisation chez Escherichia coli : élaboration de cribles génétiques pour la détection d'interactions protéine-protéine ou d'activités protéolytiques. (Nathalie Dautin - Gouzel Karimova - Agnès Ullmann et Daniel Ladant)

L'adénylcyclase de B. pertussis représente un modèle original d'enzyme bactérien activé par une protéine eucaryote, la calmoduline. Notre objectif est de décrypter les bases moléculaires de l'interaction AC/calmoduline (et l'activation qui en résulte). Des travaux antérieurs avaient montré en particulier que le domaine catalytique est constitué de deux domaines complémentaires, appelés T25 et T18, (tous deux requis pour l'activité enzymatique). Nous avons récemment entrepris d'exploiter la structure modulaire de cet enzyme pour élaborer des cribles génétiques permettant, chez E. coli, soit la détection d'interactions protéine-protéine, soit la détection d'activités protéolytiques site-spécifiques.

Dans le premier cas, dit " système double-hybride ", des protéines d'intérêts sont fusionnées génétiquement aux deux domaines T25 et T18 et co-exprimées dans une souche d'E.coli Dcya. L'association des deux protéines hybrides permet une complémentation fonctionnelle entre les deux fragments de l'AC et restaure une activité enzymatique adénylcyclase, donnant lieu à une synthèse d'AMPc qui est un régulateur pléiotrope de l'expression génétique chez E. coli. Cette cascade d'activation peut être détectée par criblage sur des milieux indicateurs ou sélectifs appropriés. Cette méthodologie est particulièrement appropriée pour analyser les relations structure/fonction des protéines. Au cours de l'année passée, nos travaux ont été consacrés à l'amélioration de ce test génétique afin notamment de faciliter le criblage à grande échelle de partenaires d'interaction d'une protéine donnée ; de tels criblages sont en cours au laboratoire pour identifier des partenaires de différentes protéines d'E. coli.

Le criblage d'activité protéolytique repose sur l'inactivation, par protéolyse spécifique, d'une AC modifiée dans laquelle un polypeptide correspondant au site de clivage de la protéase d'intérêt a été inséré entre les deux domaines T25 et T18. Dans une souche E. coli Dcya, l'inactivation de l'AC modifiée, qui reflète l'activité protéolytique in vivo, est révélée par un changement de phénotype (" Cya+ " -> " Cya- "), aisément visualisé sur des milieux indicateurs et/ou sélectifs appropriés. Nous avons élaboré cette technique en utilisant comme modèle, la protéase du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Nous avons montré en particulier que ce test est capable de détecter des protéases du VIH résistantes aux drogues antiprotéase, utilisées dans les traitements anti-SIDA. Durant ces derniers mois, nous avons exploité ce crible génétique pour tenter de comprendre l'influence des mutations de résistance sur la structure et l'activité de la protéase du VIH. Nous avons mis en évidence le rôle important des séquences polypeptidiques adjacentes à la protéase, au sein de la polyprotéine précurseur, notamment pour faciliter la dimerisation (et de ce fait l'activité protéolytique) de certaines protéases modifiées, résistantes aux inhibiteurs. D'autres travaux en cours ont pour objectif à court terme le développement d'un test de diagnostic phénotypique de la résistance du VIH aux antiprotéases.

 

VI- Apport des méthodes physicochimiques de l'Unité à diverses collaborations (Alain Chaffotte - Michel Goldberg - Roland Nageotte)

Comme c'est le cas depuis de nombreuses années, l'Unité met au service de la collectivité scientifique, en particulier pasteurienne, son équipement et ses compétences dans l'étude physico-chimique des protéines en solution et de leurs interactions. Elle participe à la conception d'expériences d'ultracentrifugation analytique, de spectroscopie de fluorescence, de dichroïsme circulaire, et de cinétiques rapides, réalise les expériences correspondantes et les interprète au bénéfice des équipes qui les sollicitent.

 

VII- ENSEIGNEMENT

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (Directeur A. Chaffotte) associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA), et une partie importante de ce cours est réalisée par le personnel de l'Unité. En particulier, deux groupes de l'Unité (Repliement des protéines in vitro et Repliement des protéines dans l'enveloppe bactérienne) ont organisé chacun 2 semaines complètes de travaux pratiques dans le cadre de ce cours en 2001.

Un étudiant de DEA et cinq thésards étaient en formation dans l 'Unité au cours de l'année académique 2000-2001.

Photo :

Figure 1: Motif antigénique du lysozyme reconnu par l'anticorps monoclonal D.1.3.

Les atomes du lysozyme qui entrent en contact avec l'anticorps (motif antigénique) sont représentés en couleur. Le squelette peptidique du lysozyme est représenté en barres blanches. Ce squelette doit se replier en une conformation bien précise pour rapprocher les uns des autres les atomes jaunes portés par une extrémité de la chaîne et les atomes rouges portés par l'autre extrémité, et les positionner avec précision pour former le motif structural reconnu par l'anticorps.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LENOIR Lucile – llenoir@pasteur.fr

BEDOUELLE, Hugues, CNRS, Directeur de Recherche 1 (hbedouel@pasteur.fr)

BETTON, Jean-Michel, CNRS, Directeur de Recherche 2 (jmbetton@pasteur.fr)

BLONDEL, Arnaud, IP, Assistant (ablondel@pasteur.fr)

CHAFFOTTE, Alain-François, IP, Chef de Laboratoire (chaffott@pasteur.fr)

ENGLAND, Patrick, IP, Chargé de Recherche (england@pasteur.fr)

GOLDBERG, Michel, IP, Professeur (goldberg@pasteur.fr)

GUEZ, Valérie, IP, Chargée de Recherche

KARIMOVA, Gouzel, IP, Chargée de Recherche (karimova@pasteur.fr)

LADANT, Daniel, CNRS, Directeur de Recherche 2 (ladant@pasteur.fr)

MEJEAN, Annick, UP7, Maître de Conférences (amejean@pasteur.fr)

DE ALMEIDA, Paulo Cezar, Chercheur post-doctoral (Brésil)

ARIE, Jean-Philippe, Doctorant UP11

BAUCHE, Cécile, Chercheur post-doctoral (France)

BODENREIDER, Christophe, Doctorant UP7

DAUTIN, Nathalie, Doctorante UP7

HERVE, Mireille, Chargée de Recherche CNRS

HUNKE, Sabine, Chercheur post-doctoral (Allemagne)

JARRETT, Nicole, Etudiante (Etats-Unis)

PHICHITH, Denis, Etudiant de DEA UP7

PLANSON, Anne-Gaëlle, Doctorante UP7

RENARD, Martial, Doctorant UP6

ULLMANN, Agnès, Professeur Honoraire IP, DREM CNRS

BELKADI, Laurent, Ingénieur d’Etudes CNRS (belkadi@pasteur.fr)

NAGEOTTE, Roland, Ingénieur Technologue IP (nageotte@pasteur.fr)

SASSOON-CLAVIER, Nathalie, Technicienne Supérieure IP (nsassoon@pasteur.fr)

NAVARRO-MARTINEZ, Maria, Responsable de Préparation IP

NGUYEN, Huu Huan, Agent Hospitalier IP

NINO, Marguerite, Agent de Laboratoire IP

THIBAUT, Florent, Agent d’Exploitation Qualifié, IP

TOMMASINO, Patrice, Agent de Laboratoire, IP


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