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  Responsable : Paul BREY (pbrey@pasteur.fr)


  resume

 

Notre Unité se concentre sur trois thèmes de recherche ayant des liens entre eux : 1) le génome d'Anopheles gambiae, 2) les interactions parasite du paludisme/moustique, en particulier au tout début du développement Sporogonique, et 3) l'immunité des insectes surtout au niveau de la cascade enzymatique qui déclenche l'encapsulation et la production de la mélanine. Notre but est de mieux comprendre comment les parasites du paludisme interagissent avec leurs insectes hôtes afin de trouver d'éventuelles solutions pour interrompre ou réguler cette interaction.



  rapport

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Identification génique chez Plasmodium — interactions avec la cellule hôte au cours du cycle sporogonique (R. Paul, A. Raibaud, K. Brahimi et Paul Brey)

Les infections par Plasmodium sont un énorme fléau de santé publique qui provoque la mort de 2 millions de personnes par an, particulièrement chez les enfants. La résistance de Plasmodium à la plupart des drogues antimalariennes est de plus en plus répandue et aucun vaccin efficace n'existe à l'heure actuelle. Une meilleure connaissance du cycle du parasite au niveau moléculaire, en particulier de ses interactions avec les cellules hôtes, devrait mener vers des stratégies alternatives dans la lutte contre le paludisme.

Actuellement, nos études font parties d'un programme transversal de recherche en collaboration avec deux autres laboratoires au sein de l'Institut Pasteur (Unité Postulante de Biologie et Génétique du Paludisme et Unité Génétique de la Différentiation). Notre programme propose l'identification et la caractérisation fonctionnelle de nouveaux gènes qui sont exprimés spécifiquement aux stades invasifs du cycle sporogonique (l'ookinète et le sporozoïte) et par les hépatocytes infectés. Pour cela nous utilisons une technique récente, l'Hybridation Soustractive Suppressive (HSS) et le système rongeur P. berghei qui présente plusieurs avantages : le cycle entier du parasite peut être maintenu au laboratoire, l'infection des hépatocytes peut être menée à terme in vitro et les études moléculaires sont facilitées par des techniques de mutagenèse dirigée simples et rapides. De cette façon, nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Génomique d' Anopheles gambiae (Charles Roth, Marine Grailles, Inge Holm et Paul Brey)

Ces dernières années, notre unité a travaillé sur le génome du moustique Anopheles gambiae, principal vecteur du parasite Plasmodium falciparum, responsable du paludisme en Afrique. L'étude des gènes qui contrôlent les multiples aspects du développement du moustique et la compréhension de son comportement et de ses réponses à l'environnement, conduiront à un meilleur contrôle de la transmission du paludisme par ce vecteur.

L'Institut Pasteur est engagé dans un consortium international qui a pris en charge le séquençage des 270 mégabases (millions de bases) du génome de ce moustique. Ce projet permettra d'identifier tous les gènes d'importance médicale et de les comparer à ceux de l'homme et du parasite Plasmodium, dont les génomes ont déjà été séquencés. Cette comparaison devrait ouvrir de nouvelles voies à la compréhension des relations hôte-vecteur et au contrôle de la maladie.

En avant-première à cet important effort de séquençage, notre laboratoire, en collaboration avec le Centre National Français de Séquençage, le Génoscope, a fourni plus de 22 000 séquences réparties de manière aléatoire dans le génome en séquençant les extrémités de grands fragments chromosomiques clonés dans des Chromosomes Artificiels Bactériens (BACs). Les séquences des extrémités de ces fragments fournissent des informations sur les chromosomes dans leur ensemble incluant les gènes, les transposons, et les séquences répétées qu'ils contiennent. Par exemple, notre analyse a mis en évidence les séquences partielles de plus de 1 000 gènes qui n'étaient pas identifiés au préalable chez le moustique. Nous avons aussi identifié de nombreux nouveaux éléments transposables, et de nouvelles familles de ces éléments qui jouent un rôle dans les réarrangements chromosomiques. De même, nous avons répertorié près de 1 000 séquences de microsatellites qui pourraient être utilisées comme "marqueurs " pour l'identification et le suivi des mouvements de populations de moustiques dans la nature.

Un deuxième projet a consisté à travailler avec le Génoscope, en collaboration avec nos partenaires allemands et américains, sur le séquençage d'une section de chromosome pour démontrer la faisabilité du séquençage d'une large portion du génome. Cette région séquencée servira de référence pour la correction de la séquence du génome entier. Cette région a été choisie parce qu'elle contenait un gène important favorisant la capacité du Plasmodium à croître et à être transmis par A. gambiae. Le Génoscope a construit une section de 500 000 bases à partir de 5 clones de BACs se chevauchant, et deux sections plus petites.

L'unité étudie aussi les gènes d'insectes codant des protéines transporteuses associées à la multi-résistance aux traitements chimiques chez l'homme. Ces transporteurs agissent au sein d'un réseau d'enzymes qui réduisent l'accumulation des toxines de l'environnement chez l'animal. Nous étudions les gènes de multi-résistance chimique et leurs produits afin de comprendre comment ces transporteurs importants fonctionnent, tant chez l'homme que chez l'insecte. En identifiant les parties de ces protéines qui sélectionnent le produit à exporter, il sera peut-être possible de concevoir des composés capables de réduire la capacité de transport de certains produits toxiques, comme les traitements anti-tumoraux humains, ou des insecticides permettant de contrôler les moustiques vecteurs de maladies.A cette fin, nous identifions les gènes codant les transporteurs qui confèrent le phénotype de multi-résistance chez la mouche du vinaigre, D. melanogaster, et le moustique vecteur du paludisme, A. gambiae. Ces études permettent actuellement d'identifier les domaines de la protéine transporteuse qui peuvent varier rapidement chez ces insectes, et qui suggèrent un rôle important dans la détermination du type de composé que le transporteur rejette de la cellule vivante. En comparant les génomes de ces insectes à celui de l'homme, nous apprenons comment l'évolution a sélectionné la variabilité et la stabilité dans les protéines qui interagissent avec les toxines de l'environnement. Nous pensons qu'en étudiant la structure et la fonction des gènes de parasites comme l'agent du paludisme, P. falciparum, et de ses hôtes, le moustique A.gambiae et l'homme, nous trouverons de nouvelles voies pour maîtriser leurs interactions et améliorer la santé publique.

 

Etude d'un inhibiteur naturel de sérine protéase (Serpine) impliqué dans la régulation de l'activation de la prophénoloxydase (Sung-Jun Han et Paul Brey)

La mélanisation chez les insectes joue un rôle important dans la réponse immunitaire. Les insectes, dépourvus d'immunoglobuline, utilisent l'encapsulation mélanotique pour séquestrer les parasites et les pathogènes dans l'hémocoel. L'enzyme principal de la synthèse de la mélanine est la phénoloxydase. La phénoloxydase existe sous forme de zymogène (prophénoloxydase) dans l'hémolymphe de l'insecte. Lorsqu'il y a blessure ou invasion, la prophénoloxydase est activée par une protéolyse limite sous l'action une sérine protéase appelée PPAE. Cet enzyme enlève un fragment de 49 acides aminés de la partie N-terminale de la prophénoloxydase pour le transformer en forme active (phénoloxidase). Cette protéase PPAE doit être elle-même régulée pour éviter la surproduction de la mélanine qui peut être mortelle pour l'insecte. Il existe une famille d'inhibiteurs naturels de sérine protéase appelés serpines. Cette famille d'inhibiteurs est très representée chez les insectes. Il y a quelques années, nous avons publié la séquence nucléotidique d'une serpine chez la processionnaire du pin, Hyphantria cunea. Lors de l'analyse de la séquence en acides aminés, nous avons découvert que la terminaison C-terminale de notre serpine était quasi identique à la partie N-terminale de la prophénolxydase surtout autour du site de clivage de la prophénoloxydase. Nous avons ensuite criblé les banques EST de Drosophila (BDGP) et avons trouvé une serpine orthologue. Nous avons pu démontrer que cette serpine était inhibitrice de l'activation de la prophénoloxydase, non seulement chez drosophile, mais aussi chez Bombyx mori et Gallaria mellonella. Cette serpine, que nous avons nommée "POPIN" (PhenolOxidase Pathway INhibitor), est composée de 447 acides aminés et porte un signal peptide dans sa partie N-terminale. Chez la drosophile, POPIN est exprimé de façon constitutive à tous les stades de développement ainsi que dans une lignée cellulaire, Drosophila Schneider cells. Afin de suivre l'activité inhibitrice de POPIN, nous avons produit des mutations (1 aa) dans le site réactif P1 du gène. Ainsi, nous avons substitué une Arg pour une Lys (POPINK406R) puis une Ala pour une Lys (POPINK406A). La mutation en Ala a aboli l'activité inhibitrice de la serpine alors que la mutation en Arg l'a seulement réduite par rapport à un "wild type" qui contient une Lys. POPIN est inhibiteur uniquement des sérines protéases du type trypsine. De plus, POPIN a manifesté une activité anti-agrégation des hémocytes et anti-coagulation de l'hémolymphe.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BLANC, Marie-France, mfblanc@pasteur.fr

BREY, Paul, IP, Chef de Laboratoire, pbrey@pasteur.fr

ROTH, Charles, CNRS, Chargé de recherche, croth@pasteur.fr

RAIBAUD, Anna, IP, Chargé de recherche, araibaud@pasteur.fr

PAUL, Richard, IP, Chargé de recherche, topotito@pasteur.fr

GRAILLES, Marine, IP Dakar, Postdoc, letocar@pasteur.fr

BRAHIMI, Karima, IP, Postdoc, kbrahimi@pasteur.fr

HAN, Sung-Jun, Yonsei Medical School, Corée, Thèse, sungjun@pasteur.fr

HOLM, Inge, IP, Ingénieur, holm@pasteur.fr

PERROT, Sylvie, IP, Technicienne, sperrot@pasteur.fr

CARMI-LEROY, Annick, IP, Technicienne

GEGAT, Catherine, IP, Agent de Laboratoire

BLANC, Marie-France, Secrétaire, mfblanc@pasteur.fr


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