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  Responsable : Florence COLBERE-GARAPIN par intérim (fcolbere@pasteur.fr)


  resume

 

Les programmes de recherche développés dans l'unité portent sur l'étude des mécanismes viraux et cellulaires qui contribuent à la pathogénie des Flavivirus (famille des Flaviviridae) et des Phlebovirus (famille des Bunyaviridae). Les principaux virus étudiés sont d'une part les flavivirus responsables de la fièvre jaune, de la dengue, et de l'encéphalite de West Nile et d'autre part le virus de la fièvre de la vallée du Rift qui est le phlebovirus responsable de fièvres hémorragiques en Afrique et au Moyen-Orient.



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1. Les interactions moléculaires virus-hôte associées à la pathogénicité des flavivirus (Marie Flamand, Philippe Desprès & Armelle Delécluse)

1.1 - Propriétés biologiques de la glycoprotéine non structurale NS1 des flavivirus (S. Alcon, F. Coulibaly, M.-T. Drouet & M. Flamand)

Conservée au sein du genre des flavivirus, la glycoprotéine non structurale NS1 est essentielle à la survie du virus. Il semble en effet qu'elle prenne part à la réplication virale, bien que son activité à proprement parler n'ait pas été identifiée. Nous avons choisi de nous intéresser aux formes extracellulaires de la protéine, observées lors d'infections flavivirales en cultures de cellules. Afin d'étudier les propriétés biologiques éventuelles de la forme sécrétée de NS1, nous avons dans un premier temps caractérisé son mode de maturation et de transport en cellules de rein de singe (lignée fibroblastique Vero) infectées par le virus de la dengue. Si la protéine NS1 réside en partie dans un compartiment précoce des voies de sécrétion, où sa présence pourrait être requise lors de la réplication virale, elle est alternativement sécrétée de manière hôte dépendante dans le milieu extracellulaire des cellules infectées sous la forme d'hexamères solubles et homogènes. Leur sécrétion est favorisée par la maturation complète de l'un des deux oligosaccharides, ce qui pourrait corroborer l'absence de sécrétion de la protéine dans des lignées de cellules d'insectes dont le système de biosynthèse des sucres génère des N-glycanes riches en mannoses. Afin de mettre en évidence in vivo la présence d'une forme sécrétée de la protéine NS1 chez les patients infectés par le virus de la dengue, nous avons développé un test ELISA-capture permettant la détection sérique de la protéine. L'étude menée sur une cohorte de sérums de patients infectés par le virus dengue 1 provenant de Guyane Française montre que la protéine est détectable dès le premier jour après l'apparition des symptômes et ce jusqu'au sixième jour au moins. La protéine NS1 est donc mise en évidence avant la détection des IgM et perdure après l'apparition de ces anticorps. Le taux de protéine NS1 sérique varie selon les individus de 0,1 à plusieurs dizaines de µg/ml de sérum, et fluctue au cours du temps pour un même patient. Une éventuelle corrélation entre le taux de protéine sérique et la gravité de la maladie est en cours d'étude. L'implication de la forme circulante de NS1 dans la pathophysiologie de l'infection flavivirale est en cours d'étude. (Coll. : M. Arborio, S. Dartevelle, A. Falconar, J. Krinsje-Locker, J. Lepault, F. Nato, F. Rey & A. Talarmin).

 

1.2 — Mécanismes d'induction de l'apoptose liée à l'infection par les flavivirus (A. Catteau & P. Desprès)

La mort cellulaire par apoptose est un système de défense innée de l'hôte qui peut être déclenchée en réponse à une infection virale. Les virus de la dengue (DEN) sont capables d'induire l'apoptose des cellules cibles telles que les cellules hépatiques, les neurones et les cellules endothéliales. Les voies apoptotiques activées varient selon le type cellulaire infecté. Les mécanismes moléculaires impliqués dans le processus apoptotique ne sont pas tous élucidés, mais nous avons pu identifier des déterminants viraux qui influent sur l'apoptose consécutive à l'infection par le virus DEN. La cinétique de déclenchement de l'apoptose est liée à l'efficacité de réplication du virus DEN dans la cellule hôte. La glycoprotéine d'enveloppe E et le domaine hélicase à ARN de la protéine NS3 portent des déterminants qui ont un effet sur l'induction de l'apoptose par leur action sur la morphogenèse virale et les fonctions réplicatives du virus. Nous avons cherché à déterminer si l'apoptose consécutive à l'infection virale est dépendante de facteurs viraux spécifiques. L'induction de l'apoptose est liée à l'expression des glycoprotéines de l'enveloppe prM (précurseur intracellulaire de la protéine M du virion) et E. Nos études ont permis de relier le transport de la protéine M dans la voie de sécrétion à l'induction de l'apoptose. Le rôle de la protéine M dans la pathogénicité des flavivirus est en cours d'analyse. (Coll. : P. Charneau, M.-L. Gougeon, F. Penin)

 

1.3. - Etude de la neuropathogénicité du virus West Nile

(Programme Transversal de Recherche 21 ; coordonnateur Philippe Desprès) (S. Alcon, F. Coulibaly, P. Desprès, M.-T. Drouet, M. Flamand, M.-P. Frenkiel & M. Lucas)

L'émergence d'un nouveau variant du virus West Nile (WN) coïncide avec la recrudescence de la zoonose en Europe comme au Moyen Orient et sa récente introduction en Amérique du Nord où elle était jusqu'alors inconnue. Chez l'homme, l'infection par le virus WN peut être symptomatique et la méningo-encéphalite est la forme sévère de la maladie. La contribution des facteurs génétiques de l'hôte dans la sévérité de l'infection par le virus WN est étudiée dans un modèle murin d'infection expérimentale. La majorité des lignées de souris consanguines de laboratoire sont sensibles à l'infection virale tandis que celles issues de lignées de laboratoire dites sauvages sont résistantes. Le phénotype de résistance/sensibilité chez la souris est corrélée à la présence d'une mutation dans le gène codant l'isoforme L1 de la molécule 2'-5' OligoAdenylate Synthétase (2'-5'OAS), une enzyme du système anti-viral 2'-5'OAS/RNase qui est sous le contrôle transcriptionnel de l'interferon-a et activée par les ARN double-brins. Il s'agit de vérifier si la variabilité génétique de ce gène contribue effectivement à la sévérité des infections à flavivirus. (Coll.: J.-L. Guénet, P.-E. Ceccaldi & C. Julier).

 

1.4 - Bases moléculaires des interactions moustiques-flavivirus

(Programme Transversal de Recherche 23 ; coordonnateur: Armelle Delécluse)

L'analyse des interactions existant entre les moustiques et les virus qu'ils transmettent est un point crucial pour comprendre la transmission de certains flavivirus (dengue, fièvre jaune, West-Nile…) et développer de nouveaux outils capables de prévenir la dispersion des maladies correspondantes.

1.4.1 - Identification des déterminants moléculaires responsables de la compétence vectorielle (V. Mayau & A. Delécluse)

Les causes de l'expansion de certaines flaviviroses (dengue, West-Nile), ou de leur absence sur certains continents (fièvre jaune en Asie), semblent liées à la " compétence " des vecteurs à transmettre de façon plus ou moins efficace les différents virus. Cette variabilité de compétence pourrait s'expliquer par la présence, chez certaines populations de moustiques, de récepteurs spécifiques du virus et/ou une différence de réplication du virus chez cet hôte. Différentes approches (résonance plasmonique de surface, hybridation in situ…), visant à identifier les facteurs impliqués dans la compétence vectorielle, sont actuellement développées.

1.4.2 - Evolution du génome viral chez le moustique (V. Juárez-Pérez, V. Mayau & A. Delécluse)

La diversité génétique du virus de la dengue tend à s'accroître. Cette évolution pourrait être le résultat de remaniements (mutations, recombinaison) du génome viral, lors de la réplication chez le moustique Aedes aegypti. Des variants du génome de la dengue sont actuellement recherchés après infection d'Aedes aegypti avec un sérotype unique ou coinfection avec deux sérotypes différents.

2 - Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (Michèle Bouloy)

Pour la première fois en Octobre 2000, le virus a été introduit au Proche-Orient, créant une grave épidémie en Arabie Saoudite et au Yémen. Ce virus enveloppé possède un génome composé de trois segments d'ARN (L, M, S) de polarité négative dont un, le segment S, est ambisens et code pour deux protéines, la nucléoprotéine N et une protéine non structurale NSs dont la fonction n'était pas connue. Notre objectif a été de déterminer le rôle de cette protéine.

2.1 - La protéine NSs (A. Billecocq & P. Vialat)

La protéine NSs se localise en majorité dans le noyau où elle forme des filaments. L'analyse de différents mutants ponctuels ou de délétion exprimés à l'aide du réplicon Semliki montre que le domaine formé par les dix acides aminés C-terminaux est responsable de la formation du filament mais pas de la localisation nucléaire. Ce domaine contient deux sérines qui sont phosphorylées et présentent une séquence consensus de reconnaissance par la caséine kinase II. Ces deux sérines phosphorylées ne jouent pas de rôle important dans le processus de formation du filament car, la protéine où ces deux serines ont été mutées en alanine continue à former le filament nucléaire. On ignore si des protéines cellulaires sont associées à NSs pour constituer le filament. L'implication de l'actine a été recherchée, mais cette protéine n'a pas été détectée dans le noyau. Le clone 13 a été isolé d'une souche de virus provenant d'un cas humain en République d'Afrique centrale. Ce virus possède une délétion de 70% de la région codante pour NSs et il est avirulent pour les rongeurs qui représentent un excellent modèle animal. Dans les cellules infectées par le clone 13, la protéine NSs tronquée ne forme pas de filament et reste dans le cytoplasme où elle est dégradée. Des réassortants avec Clone 13 et une souche virulente ont permis de montrer que le segment S est porteur d'un déterminant important de virulence ou d'atténuation. Bien que NSs ne soit pas indispensable à la réplication du virus dans les cultures cellulaires, elle joue un rôle majeur chez l‘animal en bloquant la production d'interféron de type I.

2.2 - Transcription et réplication du génome (N. Le May & N. Vahsen)

Un nouveau système reconstitué à partir d'expression de cADN plasmidique est développé pour analyser la transcription et de la réplication. La synthèse de l'ARN matrice est placée sous la dépendance du promoteur de l'ARN polymérase I qui produit des ARN qui ne sont ni coiffés ni polyadénylés, comme le sont les génomes viraux. Les protéines L et N formant le complexe de transcription seront exprimées sous la dépendance du promoteur CMV. Ce système nous permettra d'établir les bases d'un système de génétique inverse. Par ailleurs, d'autres études ont montré que la protéine N forme des dimères qui pourraient être impliqués dans la transition entre la transcription et la réplication.

2.3. - Mise au point de techniques (A. Billecocq, D. Coudrier, H. Zeller, J.M. Reynes & M Bouloy)

Le diagnostic des affections liées aux hantavirus présents en France repose essentiellement sur la sérologie. La protéine N a été exprimée par le réplicon du virus de la forêt de Semliki et s'est révélée très efficace pour la détection d'IgM et IgG. Dans le cadre de l'étude des hantavirus portés par les rongeurs dans la région de Pnomh Penh au Cambodge, nous avons montré que les hantavirus de cette région sont du type asiatique Seoul-like transmis par les rats. Une méthode de diagnostic rapide (RT-PCR en temps réel) a été mise au point pour le virus de la fièvre de la vallée du Rift et le virus Puumala (coll D ; Garin, CRSSA, Grenoble).



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

BADELLA Jacqueline jbadella@pasteur.fr

MILLIOT Brigitte bmilliot@pasteur.fr

BILLECOCQ Agnès, chargée de recherche IP abilleco@pasteur.fr

BOULOY Michèle chef de laboratoire IP mbouloy@pasteur.fr

DELECLUSE Armelle chargée de recherche IP armdel@pasteur.fr

DESPRES Philippe chargé de recherche IP pdespres@pasteur.fr

FLAMAND Marie chargée de recherche IP mflamand@pasteur.fr

JUARES-PEREZ Victor chercheur contractuel vicjua@pasteur.fr

LUCAS Marianne chercheur contractuel mlucas@pasteur.fr

ALCON Sophie, Doctorante (Univ. Paris 7)

CATTEAU Adeline, Doctorante (Univ. Paris 6)

COULIBALY Fasséli, Doctorant (Univ. Paris 11)

GARCIA Stéphan, Doctorant (Univ. de Marseille)

GAULIARD Nicolas, Etudiant DEA (Univ. Paris 7)

LE MAY Nicolas, Doctorant (Univ. Paris 7)

VAHSEN Nicola étudiante (Univ. de Heidelberg ) diploma thesis

DROUET Marie-Thérèse, Technicienne Supérieure, mtdrouet@pasteur.fr

FRENKIEL Marie-Pascale, Technicienne Supérieure, mpfrenk@pasteur.fr

MAYAU Véronique, Technicienne Supérieure, vmayau@pasteur.fr

MEGRET Françoise, Ingénieur (< 07/01), fmegret@pasteur.fr

OLLIVIER Noëlle, Aide de Laboratoire ollivier@pasteur.fr

PALMYRE Jocelyne, Agent de Laboratoire

ROTSEN Rolande, Aide de Laboratoire

TAMIETTI Carole, Agent de Laboratoire

VIALAT Pierre, Technicien supérieur pvialat@pasteur.fr


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