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  Responsable : COURVALIN Patrice (pcourval@pasteur.fr)


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L'Unité des Agents Antibactériens étudie le support génétique, les mécanismes biochimiques, l'expression hétérospécifique, l'évolution et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes pour l'homme, notamment dans les systèmes suivants : entérocoques et glycopeptides, la résistance aux aminosides chez les bacilles à Gram négatif ainsi que le transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères.



  rapport

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Une mutation dans l'ARN ribosomal 23S est responsable de la résistance aux macrolides à 16 atomes et aux streptogramines chez Streptococcus pneumoniae

Les macrolides sont largement prescrits pour le traitement empirique des infections respiratoires communautaires et peuvent être utilisés dans le cas d'intolérance ou de résistance aux ß-lactamines. Les deux mécanismes de résistance aux macrolides les plus répandus sont spécifiés, soit par le gène ermB codant pour une méthylase qui diméthyle A2058 de l'ARN ribosomal 23S conférant une résistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines B (MLSB), soit par le gène mef(A) codant pour une pompe d'efflux spécifique des macrolides à 14 et 15 atomes. Récemment, S. pneumoniae BM4455 résistant aux macrolides à 16 atomes et aux streptogramines a été isolé en clinique. Ce phénotype de résistance inhabituel était du à une mutation A2062C (numérotation de Escherichia coli) dans le domaine V des 4 copies de l'ARN ribosomal 23S présentes chez S. pneumoniae. Avec l'émergence de nouveaux phénotypes de résistance, il semble nécessaire de tester in vitro l'activité d'au moins un représentant de chaque classe d'antibiotiques appartenant aux macrolides à 14, 15 et 16 atomes, aux kétolides, aux lincosamides et aux streptogramines.

 

Une pompe d'efflux du type " Resistance-nodulation-cell division " est responsable de la résistance aux aminosides chez Acinetobacter baumannii

La souche de A. baumannii BM4454 résistait à tous les aminosides et ne produisait pas d'enzyme inactivatrice de ces antibiotiques. Le gène adeB codant pour une protéine homologue aux protéines membranaires des systèmes " Resistance Nodulation cell Division" (RND) a été cloné. L'inactivation de ce gène par recombinaison homologue à permis d'obtenir le dérivé BM4454-1 sensible aux aminosides, fluoroquinolones, tétracyclines, chloramphénicol, érythromycine, triméthoprime et au bromure d'éthidium (BET). L'analyse des séquences flanquantes a indiqué que le gène adeB était encadré par les gènes adeA et adeC qui codent, respectivement, pour une protéine de fusion et une protéine de la membrane externe. En amont de cet opéron se trouvent trois cadres de lecture ouverts. Les deux premiers codent pour des protéines apparentées à celles des systèmes régulateurs à deux composants. Le mécanisme d'efflux et sa dépendance de la force proton motrice ont été démontrés à l'aide d'expériences de cinétique d'accumulation du BET avec et sans CCCP chez BM4454 et BM4454-1. L'isolement de nombreuses souches cliniques de A. baumannii présentant un phénotype de résistance similaire suggère que la pompe AdeABC joue un rôle important dans la résistance clinique de cette bactérie aux antibiotiques.

 

Regulation de l'expression de l'opéron vanD de résistance aux glycopeptides de Enterococcus

Dans l'opéron vanD de résistance aux glycopeptides, vancomycine et teicoplanine, de E. faecium BM4339, les gènes de structure du système de régulation à deux composants VanRD-VanSD étaient cotranscrits à partir du promoteur PRD alors que la transcription des gènes vanYD, vanHD, vanD, vanXD était initiée à partir du promoteur PYD situé entre vanXD et vanYD. Le système de régulation VanRD-VanSD active très probablement la transcription des gènes de résistance à partir du promoteur PYD. Des dérivés de BM4339 sensibles aux glycopeptides ont été obtenus par transcomplémentation de la mutation par déplacement du cadre de lecture du gène ddl de la D-alanine :D-alanine ligase dans cette souche. Le transformant BM4409 sensible aux glycopeptides, qui produisait uniquement des précurseurs du peptidoglycan terminés en D-alanyl-D-alanine, n'exprimait pas les gènes spécifiant la D,D-carboxypeptidase VanYD, la déshydrogénase VanHD, la ligase VanD et la D,D-dipeptidase VanXD, bien que la région régulatrice de l'opéron vanD soit transcrite. Chez BM4409, l'absence de transcription à partir du promoteur PYD corrélait avec l'absence de précurseurs terminés en D-alanyl-D-lactate. Le gène VanXD était transcrit dans BM4339 mais des quantités détectables de la D,D-dipeptidase VanXD n'étaient pas synthétisées. Cependant, le gène dirigait la synthèse d'une enzyme active après clonage sur un vecteur multicopie chez Escherichia coli, ce qui suggère que l'enzyme était instable chez BM4339 ou qu'il avait une faible activité détectable seulement avec effet de clonage de gène. Cette activité n'est pas requise pour la résistance aux glycopeptides chez BM4339 dans la mesure où cette souche ne peut pas synthétiser de D-alanyl-D-alanine.

Séquence du gène ddl et modélisation de la D-alanine:D-alanine ligase mutée de souches de Enterococcus dépendantes des glycopeptides

La dépendance des entérocoques aux glycopeptides pour leur croissance est la conséquence de mutations dans le gène ddl qui inactivent la D-Ala:D-Ala ligase de l'hôte. Les souches requièrent les glycopeptides comme inducteurs de la synthèse des protéines de résistance, ce qui permet la production de précurseurs du peptidoglycane terminés en D-Ala-D-Lac au lieu de D-Ala-D-Ala. La séquence des gènes ddl de neuf isolats cliniques de E. faecium dépendants des glycopeptides a été déterminée. Chacun avait une mutation consistant, soit en une insertion de 5 pb à la position 41 introduisant un codon stop, soit une délétion en phase de 6 pb entraînant la perte de deux résidus (KDVA243-246 en KA), soit de changements d'une seule pb conduisant à une substitution d'acide aminé (E13 Õ G, G99 Õ R, V241 Õ D, D295 Õ G, P313 Õ L). Les conséquences de ces mutations sur la structure tridimensionnelle de l'enzyme ont été évaluées par modélisation moléculaire comparative de l'enzyme de E. faecium en utilisant comme matrice la structure déterminée aux rayons X de la D-Ala:D-Ala ligase DdlB de E. coli. Tous les résidus mutés, soit intéragissaient directement avec un des substrats de la réaction enzymatique (E13 et D295), soit stabilisaient la position de résidus critiques dans le site actif. Le maintien de la structure tridimensionnelle du site actif dans le voisinage de ces mutations semble critique pour l'activité D-Ala:D-Ala ligase.



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