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  Responsable : HOVANESSIAN Ara (arahovan@pasteur.fr)


  resume

 

Nous étudions les mécanismes impliqués dans la pathogénie du SIDA en relation avec l'infection par le virus d'immunodéficience humaine, VIH. Par ailleurs l'infection virale conduit à la production d'interféron, qui joue le rôle de première barrière contre l'extension de la virémie. Dans cette optique, les principales lignes de recherche sont les suivantes : 1) développement des inhibiteurs de l'infection par le VIH, 2) étude des composants à la surface cellulaire impliqués dans le processus d'accrochage du VIH, 3) Etude de l'induction des gènes des interferons alpha par l'infection virale, 4) caractérisation des différentes fonctions de la protéine kinase PKR.



  rapport

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Inhibition de l'infection du VIH par le pseudopeptide HB-19 qui forme un complexe avec la nucléoline de surface (Le Clech M., Nisole S., Krust B., Hovanessian A.G.)

Le pseudopeptide 5[KyCH2N)PR]-TASP, nommé HB-19, inhibe l'infection des PBMC et des macrophages primaires par divers isolats du VIH. Des pseudopeptides apparentés possédant la même charge globale positive sont inactifs, même à des doses très élevées. L'action anti-VIH de HB-19 est spécifique car elle n'a pas d'effet sur des pseudotypes du VIH exprimant les glycoprotéines d'enveloppe du VSV ou du MoMLV. HB-19 se fixe aux cellules en formant un complexe avec la nucléoline exprimée à la surface cellulaire indépendamment des sulfates d'héparane et de l'expression du CD4; ceci empêche l'attachement des particules virales aux cellules. Le VIH a la capacité d'empêcher la formation de ce complexe, suggérant ainsi que la nucléoline de surface est la cible commune aux virus et au HB-19, impliquée dans l'attachement des particules virales aux cellules cibles.
L'action anti-VIH de HB-19 persiste plus de 8 h dans des cellules prétraitées. Par ailleurs, l'association de faibles doses d'HB-19 et de b
-chemokines ou d'AZT conduit à une augmentation sensible de l'inhibition du VIH. Vu son mode d'action particulier, HB-19 est un bon candidat pour servir de modèle au développement de nouvelles drogues anti-VIH. Des études sont actuellement en cours pour parvenir à une émergence potentielle de virus résistants à HB-19 dans des cultures virales prolongées en présence de l'inhibiteur. La caractérisation de ces mutants permettra de mieux comprendre le rôle de la nucléoline de surface et de définir les domaines de gp120 impliqués dans le processus d'attachement du VIH.


L'expression de la nucléoline à la surface cellulaire est dépendante de son association avec le cytosquelette de l'actine.(J. Svab, N. Robert, A. Hovanessian).

La nucléoline est une protéine ubiquitaire, extrêmement conservée chez différentes espèces animales. Nous avons tout d'abord entrepris une étude de biologie cellulaire, visant à mieux comprendre l'expression de surface de la nucléoline, expression déjà décrite mais jamais étudiée. Par microscopie confocale et électronique, nous avons montré que la nucléoline est présente dans le cytoplasme, au sein de structures vésiculaire, qui pourraient être impliquées dans la translocation de la nucléoline à la surface cellulaire. La translocation de la nucléoline est réduite à basse température ou en absence de sérum, alors que les inhibiteurs conventionnels du transport intracellulaire des glycoprotéines sont sans effet. La translocation de la nucléoline paraît donc une conséquence d'un transport actif, indépendant du complexe reticulum-Golgi. A la surface cellulaire, les anticorps monoclonaux dirigés contre la nucléoline provoquent une agrégation de la nucléoline au niveau de la phase extra-cellulaire de la membrane plasmique. Cette agrégation de la nucléoline de surface est dépendante de son association avec le cytosquelette de l'actine intracellulaire. Par conséquent la destruction du réseau d'actine par la cytochalasine D entraîne une désorganisation de la nucléoline de surface mais toujours associée avec l'actine agrégée . Ces observations suggèrent fortement que la nucléoline est un composant de la matrice extra-cellulaire, en étroite association avec l'actine, association probablement due à une tierce protéine transmembranaire, vraisemblablement un protéoglycane. Dans ces conditions, la nucléoline pourrait constituer le récepteur de surface des différents ligands.


Le facteur de croissance midkine est une cytokine qui inhibe l'infection par le VIH. (Krust B., Nisole S., Said E., Hovanessian A.G.).

La fixation du VIH aux cellules est inhibée par le pseudopeptide HB-19 qui se fixe spécifiquement à la nucléoline exprimée à la surface cellulaire. Les résultats ici présentés démontrent que la Midkine (MK), un facteur de croissance qui présente une affinité pour la nucléoline, est un inhibiteur spécifique de la fixation du VIH aux cellules. La fixation du VIH à la surface des cellules est inhibée par HB19 ou MK indépendamment de l'expression du CD4, ce qui suggère qu'ils interfèrent avec une étape précoce du processus d'attachement du virus aux cellules. La fixation de MK aux cellules est spécifique dans la mesure où il y a compétition entre MK-125I et un excès de MK froide, alors que des facteurs de croissance apparentés n'entrent pas en compétition. Par ailleurs la fixation de MK est fortement inhibée par le HB19, ce qui suggère que la nucléoline exprimée à la surface des cellules est un récepteur de MK.
L'ARN messager de MK est détectable dans les cellules mononucléées du sang périphérique de donneurs sains, et son expression est fortement augmentée après activation des lymphocytes T. Le mode d'action anti-VIH de MK et l'induction transitoire de son expression dans les lymphocytes en réponse à divers stimuli, tendent à démontrer que MK est une cytokine impliquée dans la pathogénèse associée à l'infection par le VIH. En accord avec ceci, des clones de cellules CEM qui expriment de façon constitutive MK présentent une résistance à l'infection par le VIH, résistance liée à un blocage de la fixation des particules virales. Par ailleurs la coculture de cellules HeLa qui expriment MK avec des cellules HeLa CD4+ confère à ces dernières une résistance au VIH.


L'entrée du VIH dans les cellules CD4+ entraîne la translocation de la nucléoline de surface vers le cytoplasme. (Nisole S., Le Clech M., Svab J., Krust B. et Hovanessian A.G.)

Le pseudopeptide HB-19 qui se complexe à la nucléoline exprimée à la surface cellulaire inhibe l'infection par le HIV en bloquant l'attachement des particules virales aux cellules permissives. Nous démontrons dans cette étude l'implication directe de la nucléoline dans l'infection par le VIH, se basant sur l'observation selon laquelle l'expression de la nucléoline présente au niveau de la surface cellulaire est réduite de façon drastique suite à l'entrée des particules de VIH. Cette réduction est systématiquement observée dans différents types cellulaires 5 heures après infection et est strictement corrélée à la capacité d'un isolat donné à infecter sa cellule-cible. L'entrée du VIH dans les cellules est responsable de cette diminution puisque celle-ci n'intervient pas suite à l'inhibition de l'entrée virale par des agents qui empêchent la fusion membranaire sans affecter la fixation des particules du VIH. De plus, l'inhibition de la rétrotranscription par l'AZT n'a aucun effet sur la réduction de la nucléoline de surface du fait que l'AZT n'intervient pas sur l'entrée du VIH.
Des expériences détaillées sur des cellules HeLa et sur des macrophages primaires ont démontrées que la réduction du taux d'expression de la nucléoline à la surface cellulaire est une conséquence d'une translocation de la nucléoline de surface vers le cytoplasme au cours de l'entrée virale. De plus, cette translocation semble être corrélée à une augmentation de l'association de la nucléoline avec le cytosquelette. Etant donné que la nucléoline a été décrite comme une protéine navette, elle pourrait constituer une protéine "chaperon" pour le VIH lors de l'infection.


Etude de l'induction des gènes des interferons alpha par l'infection virale (I. Marié, A. Caillaud).

L'objectif de ce programme est d'identifier de nouveaux gènes cibles du facteur de transcription IRF7 (Interferon Regulatory Factor) impliqués dans les processus de défense cellulaire antivirale et antitumorale. Récemment, nous avons démontré que IRF7 est responsable de l'induction différentielle d'une sous-classe d'interférons de type I en réponse à l'infection virale. IRF7 est essentiel pour assurer le feedback positif de l'interféron sur sa propre synthèse et assurer une réponse antivirale maximale en réponse à l'infection virale. IRF7 jouant un rôle déterminant dans l'induction des gènes des interférons alpha, il apparaît nécessaire d'identifier quels sont les autres gènes régulés parallèlement par IRF7. les interférons ainsi que les produits de ces autres gènes (comme il a été montré dans le cas de IRF1) pourraient ensuite agir de façon coordonnée et médier les mécanismes généraux antiviraux et antitumoraux. Afin de mettre en oeuvre ce projet, une lignée cellulaire exprimant une forme constitutivement active de IRF7 sera générée. Les gènes induits résultant de la surexpression de cette forme de IRF7 seront isolés par des techniques de "GeneChip Array" et d'amplification/hybridation soustractive (representational Difference Analysis) en comparaison avec la lignée cellulaire parentale et seront caractérisés. leur rôle potentiel dans les processus de carcinogénèse ou de défense antivirale sera testé. Le promoteur du gène de IRF7 humain sera également étudié et son induction par différents agents carcinogènes et autres stimuli sera testé. Enfin l'obtention d'un clone génomique nous permettra d'effectuer une recherche systématique en cytogénétique afin de déterminer si des anomalies du gène IRF7 sont présentes dans différents types de tumeur.


PKR et voies de signalisation MAP/SAP kinases (E. Meurs)

Les ARNs bicaténaires s'accumulent dans les cellules de mammifères infectées par de nombreux virus et entrainent l'activation des mécanismes de défense cellulaires du système interféron (IFN). La PKR est une protéine sérine/thréonine qui est fortement induite dans les cellules après traitement par les IFNs et qui présente deux motifs de liaison aux ARNs bicaténaires (DRBD) dans son domaine N terminal. La PKR s'active par autophosphorylation après liaison sur les ARNs bicaténaires. Une fois activée, elle catalyse la phosphorylation du facteur eIF-2a
d'initiation de la traduction. Ceci inhibe la synthèse protéique et permet de bloquer les propagations virales. Une autre inhibition de la synthèse protéique est exercée par l'activation de la voie enzymatique 2-5A synthétase/RNAse L, elle aussi dépendante d'ARNs bicaténaires et inductible par l'IFN. Cette voie conduit à la dégradation des ARNs messagers et ribosomaux.
Divers signaux extracellulaires activent la famille des MAP/SAP kinases. Les SAP kinases (Stress-activated kinases) JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) et p38MAPK s'activent dans des conditions de stress pour les cellules, telles que choc thermique, choc osmotique, rayonnement UV ou inhibiteurs de synthèse protéique. Après activation, JNK phosphoryle et active des facteurs de transcription permettant à la cellule de récupérer et de survivre après les dommages qu'elle a subis. A l'aide de cellules invalidées en PKR et en RNAse L, nous avons montré que ces deux voies d'inhibition sont impliquées dans l'activation de JNK kinase par les ARNs bicaténaires, probablement via l'arrêt de synthèse d'un inhibiteur à demi-vie courte qui agirait en amont de SEK1/MKK4. L'activation de p38MAPK par les ARNs bicaténaires est, elle, indépendante de PKR et RNAse L.


PKR et voie de signalisation NF-kB (M. Bonnet, E. Meurs)

La PKR est impliquée dans l'induction de l'expression de certains gènes, dont celui de l'IFNb, en activant la voie de signalisation NF-kB, un facteur de transcription ubiquitaire. En l'absence de stimulation, NF-k
B, présent sous forme latente dans le cytoplasme, est complexé à un inhibiteur de la famille des protéines IkB. En réponse à de nombreux stimuli (TNFa, IL-1b, LPS, dsRNA), IkB est phosphorylé par le complexe kinase IkB (IKK), ubiquitinylé puis dégradé par le protéasome 26S. NF-kB est alors transloqué vers le noyau. Le complexe IKK contient deux sous-unités catalytiques, IKKa et IKKb et la proteine NEMO (NF-kB Essential Modulator) qui interagit avec IKKb et régule son activité kinase. La sous-unité IKKb est l'effectrice majeure de la phosphorylation d'Ik
B. L'expression de la PKR et de différents mutants catalytiques inactifs de la PKR dans un test rapporteur nous a permis de démontrer que la PKR stimule la voie NF-kB indépendamment de sa fonction kinase. Cette stimulation s'effectue par activation du complexe IKK. Nous avons démontré par des expériences de co-immunoprécipitation et d'interaction in vitro avec de la GST-PKR, que la PKR interagit avec le complexe IKK, et plus spécifiquement avec la sous-unité catalytique principale IKKb
.
Les deux études décrites ci-dessus montrent que la PKR joue un double rôle dans l'action de l'IFN: (i) en tant que kinase, la PKR régule la synthèse protéique, ce qui permet de limiter la propagation virale mais aussi de renforcer l'induction de l'IFN, via l'activation de JNK et (ii) en tant que protéine, PKR active le complexe IKK par interaction proteine/protéine et permet également l'induction de l'IFN, cette fois via l'activation de NF-k
B.


PKR et TRBP (M. Bonnet, E. Meurs)

L'importance de la PKR en tant qu'agent antiviral est mis en évidence par des stratégies que peuvent utiliser de nombreux virus pour bloquer son activation. Celles-ci comprennent l'expression d'ARNs compétitifs inhibiteurs (par exemple, l'ARN VA I de l'adénovirus, les ARNs EBER du virus d'Epstein-Bar) ou de protéines inhibitrices (par exemple, les protéines E3L et K3L du virus de la vaccine, la protéine NS1 du virus Influenzae). L'activation de PKR peut aussi être bloquée par des interactions protéine/protéine avec des protéines cellulaires particulières comme la protéine TRBP (TAR RNA binding protein), la protéine p58 IPK ou la protéine L18 de la sous-unité 60s ribosomale. TRBP a été identifiée pour sa capacité à se lier à l'ARN TAR présent en 5' des ARNm du VIH-1. Elle appartient à la famille des protéines se liant aux ARNs bicaténaires comme PKR et présente deux motifs DRBD dans sa partie N terminale, similaires à ceux de la PKR. TRBP inhibe la fonction kinase de la PKR, à la fois par sequestration d'ARNs bicaténaires activateurs de la PKR et par hétérodimérisation avec la PKR via ses domaines DRBD. En test rapporteur, nous avons confirmé que TRBP était capable d'interférer avec la fonction kinase de la PKR. Cependant, TRBP n'est pas capable d'inhiber la fonction de stimulation de la voie NF-kB par la PKR.
La fonction physiologique de TRBP n'est pas seulement restreinte à sa fonction d'inhibition de la PKR.TRBP stimule la traduction in vitro de transcrits contenant des structures ARN bicaténaire en 5' (région TAR du VIH). Nous avons montré que la transfection de vecteurs exprimant TRBP dans des fibroblastes embryonnaires invalidées en PKR permet de stimuler l'expression d'un gène rapporteur contenant la région TAR à son extrémité 5' terminale.

3) Etude de l'interaction des protéines du VHC avec l'action antivirale de IFN (E. Meurs)
Nous avons utilisé une lignée cellulaire humaine inductible exprimant les protéines structurales et non structurales du VHC pour étudier l'effet de l'expression des protéines du VHC sur l'action de l'interféron, et en particulier l'interaction PKR/NS5A. Nous avons montré que l'expression des protéines du VHC dans leur contexte biologique interfère avec le développement de l'action antivirale de l'interféron. Bien qu'une inhibition de la PKR (soit par NS5A soit par une autre protéine virale) à un niveau très local ne puisse être exclue, il ne semble pas que l'on puisse expliquer la résistance de HCV à l'interféron par l'inhibition de la PKR au niveau de son contrôle général sur la traduction.



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