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  Responsable : LABIGNE, Agnès (alabigne@pasteur.fr)


  resume

 

Les travaux de l'Unité portent sur l'étude du pouvoir pathogène de deux espèces bactériennes associées aux muqueuses: Helicobacter pylori qui colonise exclusivement la muqueuse gastrique humaine et qui est impliquée dans la genèse des pathologies gastro-duodénales inflammatoires (gastrites chroniques, ulcères peptiques, atrophie et cancer gastrique), et les Escherichia coli pathogènes colonisant les muqueuses intestinale et urinaire qui sont associés à certaines des infections diarrhéiques et urinaires. Génomique fonctionnelle, génétique moléculaire, génomique comparative, et étude des interactions de ces microorganismes avec les cellules hôtes figurent au nombre des approches mises en œuvre pour mieux comprendre la biodiversité des souches isolées en clinique et les propriétés qui leur sont associées.



  rapport

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Bactéries du genre Helicobacter

Les efforts de l'année ont été consacrés à la mise en place et au développement des études post-génomiques chez Helicobacter pylori, afin, d'une part, d'étudier la biodiversité des souches cliniques et, d'autre part, de se doter d'outils pour mettre en place les études fonctionnelles. Le but ultime est d'identifier ceux des gènes des génomes séquencés qui sont présents dans toutes les souches de H. pylori, et parmi ces gènes qui constituent le dénominateur commun à l'espèce, ceux des gènes qui sont essentiels à la croissance de H. pylori, non essentiels ou essentiels conditionnels (ex. gènes essentiels pour la survie en milieu acide, - à la colonisation de la muqueuse gastrique, - pour la survie dans un milieu carencé en certaines sources d'azotes....). A coté de ces études systématiques post-génomiques, des projets plus ciblés ont été poursuivis (étude du métabolisme de l'azote : transport de l'urée, caractérisation d'une amidase et d'une formamidase, régulation de l'expression des gènes, étude du régulateur NikR), ou entrepris (système de réparation de l'ADN chez H. pylori). Les études physiopathologiques des infections expérimentales chez la souris ont été poursuivies. Elles ont pour but de mieux comprendre les lésions pro-inflammatoires associées aux infections à Helicobacter en fonction de la réponse de l'hôte.


Utilisation des membranes à haute densité pour l'étude de la biodiversité des isolats cliniques d'origine géographique variable (Jean-Michel THIBERGE et Agnès LABIGNE)

Ce travail a eu pour but d'étudier la distribution des 1590 ORFs présentes dans le génome de la souche de H. pylori 26695, séquencée par TIGR, dans des souches provenant de patients d'origines ethniques différentes et présentant des pathologies différentes : gastrite (G); dyspepsie (D) ; ulcère duodénal (UD) ; ulcère gastrique (UG). Les ADN chromosomiques de 28 isolats cliniques, dont 26695 (UD), J99 (G), les deux souches séquencées utilisées comme contrôle, la souche adaptée à la souris SS1 (UD), et 24 souches provenant soit d'Europe, soit de Hong Kong (UG, UD, D, G), soit de Bangui et Dakar ont été utilisés comme sonde dans des expériences d'hybridation sur des membranes à haute densité sur lesquelles les produits d'amplification correspondant à chacune des ORFs du génome ont été spotés en duplicata (membranes Eurogentec). Les résultats obtenus ont permis de définir des sous-jeux d'ORFs, qui permettent une analyse à plus grande échelle de la distribution des ORFs trouvées non ubiquitaires, et la focalisation l'analyse fonctionnelle sur les ORFs ubiquitaires, spécifiques à H. pylori, et de fonction inconnue à ce jour.


Clonage et mutagenèse ordonnée et systématique de toutes les ORFs du génome de H. pylori (Chantal ECOBICHON, Catherine CHEVALIER, Denis BAYLE et Agnès LABIGNE)

Deux banques génomiques ont été construiteschez E. coli: une banque contenant individuellement toutes les ORFs clonées de H. pylori, et une deuxième banque contenant pour chacune des ORFs un pool de plasmides dans lesquels ces ORFs sont interrompues par insertion d'un transposon. L'ensemble de ces banques constitue une base d'outils postgénomiques disponibles pour l'ensemble des projets de l'Unité et exploitables à long terme à différentes fins : réamplification de l'ensemble des ORFs à volonté, pour fabriquer nos propres jeux de membranes à haute densité; identification de façon systématique du caractère essentiel de séries de gènes de H. pylori.


Etude des gènes de réparation de l'ADN chez H. pylori (Catherine CHEVALIER et Agnès LABIGNE en collaboration avec Pablo RADICELLA du C.E.A. Fontenay aux Roses)

L'objectif de ce projet est d'identifier et de caractériser les systèmes de réparation de l'ADN chez H. pylori ainsi que d'évaluer leur impact sur la variabilité génétique au sein de cette espèce. L'ensemble des gènes candidats à coder des protéines de réparation a été répertorié et inactivépour confirmer les fonctions prédites lors de l'annotation : gènes codant homologues des glycosylases (Endo III, Ung, MutY), polymérase de réparation, et un des composants du système de réparation des mésappariements (MutS). Par ailleurs, une approche biochimique a permis l'identification d'une 3-methyladenine DNA glycosylase tout à fait atypique codée par l'ORF HP0602.


Métabolisme de l'ammoniac (Hilde DE REUSE, Stéphanie BURY, Stéphane SKOULOUBRIS)

H. pylori possède un métabolisme azoté inhabituel adapté à un environnement riche en ammoniac. Pour ces raisons, nous étudions différentes voies de production de l'ammoniac chez H. pylori, par l'hydrolyse de l'urée catalysée par l'uréase et par l'activité de deux amidases paralogues. Ces deux enzymes, AmiE et AmiF, hydrolysent des amides à courtes chaînes aliphatiques pour libérer de l'ammoniac et l'acide carboxylique correspondant. Nous avons montré que ces enzymes possèdent des spécificités de substrat différentes puisque AmiE est une amidase aliphatique alors que AmiF définit un nouveau type de formamidase. Ces deux thiol-enzymes possèdent cependant des sites actifs conservés. Les amidases de H. pylori constituent donc des paralogues exemplaires puisque ces enzymes semblent avoir évolué vers une spécialisation enzymatique après duplication d'un gène ancestral. AmiE et AmiF sont impliquées dans le métabolisme de l'azote de H. pylori, leur production est dépendante de l'activité d'autres enzymes de cette voie, l'uréase et l'arginase.


Rôle de la protéine UreI dans la résistance à l'acidité de H. pylori (Hilde DE REUSE, Stéphanie BURY, Stéphane SKOULOUBRIS)

L'activité de l'uréase est cruciale pour la résistance de H. pylori aux pH extrêmement acides qu'elle rencontre dans l'estomac. Nous étudions une protéine membranaire de H. pylori, UreI, qui est indispensable pour permettre à l'urée d'être efficacement dégradée en ammoniac par l'uréase. UreI est nécessaire pour la résistance à l'acidité dans des tests in vitro. Ce phénomène a été quantifié par des mesures de production d'ammoniac révélant que la protéine UreI est spécifiquement activée lorsque le pH du milieu extracellulaire est inférieur à pH 5. Nous avons également montré que UreI est une protéine essentielle pour la colonisation gastrique d'un modèle animal murin, en particulier lors des étapes précoces. UreI présente les caractéristiques d'un système de transport d'urée et il a été montré par un autre groupe que cette protéine se comporte comme un pore à urée lorsqu'elle est exprimée au sein d'ovocytes de Xénope. La protéine UreI constitue donc un nouveau type de canal à urée activé à pH acide permettant une réponse d'urgence parfaitement adaptée à l'environnement gastrique.


Validation biologique d'interaction protéine-protéine: identification d'un anti-sigma chez H. pylori (Hilde de REUSE en collaboration avec Hybrigenics).

Un autre facteur essentiel de colonisation de H. pylori est constitué par les flagelles qui permettent à la bactérie de se mouvoir au sein du mucus gastrique. Les données de la carte d'interaction protéine-protéine de H. pylori (par double hybride) ont mis en évidence l'interaction entre une protéine inconnue HP1122 et le facteur d'initiation de la transcription sigma 28. Des régions d'interaction entre ces deux protéines ont été définies et il a été montré que HP1122 empêchait spécifiquement l'interaction entre la RNA-polymérase et le facteur sigma 28. La protéine HP1122 ressemblait donc à un facteur anti-sigma 28, de type FlgM, rôle qui a été confirmé chez H. pylori par l'analyse (i) des flagelles en microscopie électronique et (ii) de l'expression d'une flagelline. Le double hybride a donc permis d'identifier une protéine anti-sigma 28 dont la séquence est peu conservée par rapport aux autres FlgM et de montrer qu'il existe chez H. pylori une régulation temporelle de la biogenèse des flagelles.


Etude de NikR, un régulateur majeur de H. pylori (Monica CONTRERAS et Agnès LABIGNE)

Au cours des années précédentes, il avait été montré que H. pylori codait pour une protéine régulatrice NikR. La construction d'un mutant de H. pylori délété du gène a permis d'identifier les gènes cibles de NikR chez H. pylori par une analyse de type transcriptome. Il a été montré que tous les gènes cibles identifiés par l'analyse du transcriptome étaient bien affectés dans leur expression par NikR, grâce à une analyse en dot blot, puis a confirmé qu'il s'agissait d'une régulation directe de NikR sur la région promotrice de certains de ces gènes. L'ensemble des résultats montre que NikR est un régulateur avec des effets pleïotropiques, qui joue un rôle important dans la réponse aux concentrations des cations divalents chez H. pylori.


Rôle de l'inflammation due à l'infection à H. pylori sur le taux de mutation induit au niveau de la muqueuse gastrique dans le modèle des souris transgéniques "Big Blue" (Jean-Michel THIBERGE, Agnès LABIGNE, en collaboration avec Eliette TOUATI et Maurice HOFNUNG, et Michel HUERRE)

Le but de cette étude est de déterminer si le modèle des souris transgéniques "Big Blue" peut-être utilisé comme modèle pour quantifier les effets génotoxiques des différents co-facteurs répertoriés dans le processus de carcinogenèse gastrique (infection chronique à H. pylori par des souches présentant ou non certains déterminants génétiques, alimentation). Des souris C57BL/6 transgéniques contenant le transgène rapporteur lacI au niveau du chromosome de chaque cellule de l'organisme, ont été infectées avec la souche SS1 de H. pylori ou avec une souche de H. felis, bactérie colonisant la muqueuse gastrique avec des propriétés plus pro-inflammatoires que H. pylori. La détermination du taux de mutations induit au niveau de la muqueuse gastrique par l'agent chimique R7000, hautement mutagène, a été utilisée comme contrôle positif. Les premières expériences à court terme ont permis la mise au point du modèle d'infection. Les infections à H. pylori et H. felis à long terme, 6 mois et 12 mois, et l'étude de leurs effets génotoxiques sont poursuivies.


Adaptation à l'hôte murin et induction de réponses pro-inflammatoires par les souches de H. pylori (Richard FERRERO, Djilali BELAID, Pascale TROUBADOUR, en collaboration avec Dana PHILPOTT, UPMM).

Seules, certaines souches de H. pylori sont capables de coloniser la muqueuse gastrique de la souris. Afin de mieux comprendre les propriétés bactériennes impliquées dans l'adaptation de certaines souches à cet hôte, des souris ont été infectées avec des souches cliniques. L'aptitude à coloniser la souris a été corrélée négativemment à la présence du gène cagA, un marqueur de la présence de l'îlot de pathogénicité cag (PAI Cag), médiateur important du processus d'inflammation observé chez les sujets infectés par H. pylori. Parallèlement, le pouvoir d'activation de NF-kB dans des cellules AGS par chacun des différents isolats de H. pylori a été étudié par gel retard et à l'aide d'un gène rapporteur, ainsi que leur aptitude à induire la production d'IL-8 in vitro. Ces approches ont permis de statuer sur la présence ou non d'un PAI Cag fonctionnel pour chacun des isolats. L'ensemble des résultats obtenus suggère que l'aptitude des souches de H. pylori à coloniser la souris est fortement influencée par l'activité pro-inflammatoire des bactéries, via la production de facteurs codés par l'îlot cag et que H. pylori est capable de moduler négativement, par des mécanismes encore inconnus, la production de facteurs pro-inflammatoires lors de l'adaptation de la bactérie à cet hôte.


Activation du facteur transcriptionnel NF-kB in vivo par les bactéries du genre Helicobacter (Richard FERRERO, Jean-Christophe BAMBOU, en collaboration avec Sylvie MEMET de l'Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique, et Patrick AVE de l'Unité d'Histopathologie.)

Bien qu'un certain nombre d'études sur l'activation de NF-kB par H. pylori aient d'ores et déjà, été réalisées in vitro, très peu sont actuellement connues sur l'activation de ce facteur transcriptionnel in vivo. Des souris transgéniques (fournies par S. Mémet) dans lesquelles un gène rapporteur de type lacZ a été fusionné à des éléments dont l'expression est dépendante de la présence des complexes NF-kB activés, ont été infectées avec différents isolats de Helicobacter. Il est ainsi possible d'étudier chez ces souris l'activation de NF-kB en fonction de la présence, de la localisation tissulaire d'une infection à Helicobacter, et d'identifier l'origine cellulaire (inflammatoire, épithéliale ou endothéliale) d'une telle activation. Les premiers résultats ont montré que les bactéries de H. pylori, ainsi que celles de H. felis induisaient une augmentation dans la muqueuse gastrique du nombre de cellules dans lesquelles le facteur NF-kB est activé. Les populations cellulaires impliquées dans cette activation semblent être majoritairement de type épithélial et endothélial. Bien que les souches de H. pylori soient à l'origine d'une inflammation modérée chez la souris, ces bactéries sont aussi capables d'induire l'activation de NF-kB dans ce modèle.


Le rôle des réponses Th dans la genèse de lésions inflammatoires induites à la suite d'infections chroniques à Helicobacter. (Richard FERRERO, en collaboration avec Michel HUERRE et Patrick AVE de l'Unité d'Histopathologie.)

Les souris infectées chroniquement avec la bactérie H. felis développent des lésions inflammatoires sévères. Ces réponses inflammatoires sont associées à l'induction de réponses de type Th-1, sous le contrôle de cytokines pro-inflammatoires telles que l'IFN-g et l'IL-12. Les résultats d'infection chez les souris BALB/c (Th-2 prédominant) suggéraient que des réponses de type Th-2 pouvaient aussi être associées à des lésions inflammatoires. Afin de tester cette hypothèse, une lignée de souris (BALB/c) mutées dans le gène codant pour la synthèse d'IFN-g- (IFN-g-/-), ainsi que des souris congéniques (BALB/c IFN-g+/+), ont été infectées par H. felis. A 7 mois, les souris IFN-g-/- avaient développé des réponses exclusivement de type Th-2, associées à une inflammation gastrique sévère, caractérisées par une prédominance d'infiltrats de type polynucléé chez les animaux, et similaires à celles observées lors d'une infection aiguë à H. pylori chez l'homme. En revanche, une infection chronique à H. felis chez les souris congéniques était associée à l'infiltration au niveau de la muqueuse gastrique de cellules majoritairement de type mononucléaire. Ces travaux montrent que les réponses de type Th-2 peuvent être associées à l'induction de lésions inflammatoires dues à l'infection par les bactéries du genre Helicobacter.


Escherichia coli pathogènes (Chantal LE BOUGUENEC)

Il existe de nombreuses souches qui, chez l'homme et l'animal, sont responsables de processus pathogènes à localisation intestinale et extraintestinale. Chez l'homme, E. coli est reconnu par l'OMS comme la cause majeure de diarrhées bactériennes dans le monde. Par ailleurs, les infections urinaires sont l'une des principales maladies infectieuses non endémiques touchant 1 % de la population féminine adulte et, dans 80% des cas, E. coli est l'agent isolé et incriminé. Enfin, E. coli est la seconde cause de méningite néonatale et est également responsable de septicémies. Chez l'animal, les colibacilloses sont un problème majeur dans les "élevages intensifs" à cause des forts taux de mortalité et de morbidité qui leur sont associés. Bien que de très nombreux facteurs de virulence aient été identifiés, au cours des vingt dernières années, dans les populations de E. coli isolés d'échantillons prélevés dans le contexte de manifestations cliniques, et ce faisant qualifiés "de E. coli pathogènes", on est encore très loin de comprendre les processus physiopathologiques conduisant au développement des différents processus pathogènes et les modes de transmission de ces agents infectieux. Notre activité s'organise donc actuellement autour du thème "E. coli pathogènes" suivant deux axes. Une recherche fondamentale qui se fixe pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent à E. coli de coloniser et de persister chez l'homme ou l'animal et de rendre compte de la flexibilité de son génome. Une recherche plus appliquée avec une dimension épidémiologique : étude du mode de transmission des souches entre l'animal et l'homme ainsi que l'étude des "facteurs" de l'hôte favorisant ou entravant la colonisation.


Support génétique des opérons d'adhésion afa (Lila LALIOUI)

Les premiers travaux ont permis de caractériser le support moléculaire de l'adhésion de ces bactéries à la surface des muqueuses via la production d'une adhésine afimbriale (codée par l'opéron afa) qui présente l'originalité d'être produite par des souches responsables chez l'homme et l'animal d'infections intestinales et extraintestinales. L'association des opérons afa avec des éléments génétiques mobiles a été mise en évidence et pourrait contribuer à la dissémination de telles souches pathogènes entre les hommes et les animaux. La caractérisation d'îlots de pathogénicité portant des opérons afa a été réalisée ; il s'agit en particulier d'un îlot de pathogénicité portant l'opéron afa-8, identifié comme le plus répandu des opérons afa parmi les souches de E. coli associées chez l'homme et l'animal à des infections extraintestinales.

Etude de la structure adhésive AFA (Laurence du MERLE en collaboration avec Antoine TOUBERT — INSERM U396)

La structure adhésive AFA est composée à la surface de la bactérie par les protéines AfaE et AfaD. Le rôle respectif des deux protéines de la structure adhésive AFA durant l'interaction avec des cellules eucaryotes a été élucidé au cours des années précédentes grâce à des analyses génétiques et ultrastructurales de souches de E. coli de laboratoire produisant la structure AFA. Les bactéries adhèrent aux cellules par l'intermédiaire de la protéine AfaE. Nous avons mis en évience que la liaison de l'adhésine AfaE à son récepteur cellulaire, le decay-accelerating factor (CD55), induit la transduction de signaux conduisant à un phénomène de "capping" des molécules de récepteur qui entraîne la stimulation d'une réponse immunitaire innée.


Internalisation des bactéries AFA (Sandrine LE FRIEC, Laure PLANCON, Laurence du MERLE, Christine BERNIER)
Les bactéries AFA peuvent être internalisées dans les cellules eucaryotes par l'intermédiaire de la protéine AfaD. L'ensemble des résultats obtenus indique que l'internalisation des bactéries AFA est possible in vivo et doit jouer un rôle dans le développement des infections dues à ces souches qui peuvent prendre des formes aiguës ou persistantes. L'étude d'isolats cliniques a montré que les bactéries intracellulaires survivent au moins 72 h sans se multiplier dans les cellules. La caractérisation des molécules eucaryotes impliquées dans l'entrée des bactéries via AfaD a été initiée. L'implication de l'intégrineß1 dans le processus a été mise en évidence. La caractérisation des molécules AfaD a montré que cette invasine est le prototype d'une nouvelle famille d'invasines codées par des opérons d'adhésion portés par des souches pathogènes de E. coli associées à diverses infections persistantes.


Diarrhées persistantes et E. coli pathogènes (Christine BERNIER)
Notre groupe étudie également, en particulier en collaboration avec différents instituts du Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts associés, les facteurs bactériens produits par des souches de E. coli associées à des pathologies nouvelles telles les diarrhées persistantes chez les patients séropositifs pour le VIH, et le rôle respectif des facteurs bactériens et de facteurs de l'hôte dans le développement des processus pathogènes. Nous avons récemment développé un outil de diagnostic des E. coli dits entéroagrégatifs qui va permettre d'évaluer la prévalence de ces souches dans les diarrhées persistantes.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

ONDET Maxence (1/2 poste : après-midi)

LABIGNE Agnès, IP (alabigne@pasteur.fr)

LE BOUGUENEC Chantal, IP (clb@pasteur.fr)

DE REUSE Hilde, IP (hdereuse@pasteur.fr)

FERRERO Richard, IP (rferrero@pasteur.fr)

BAMBOU Jean-Christophe, (DEA)

BELAID Djilali (doctorant)

BERNIER Christine, (doctorante)

BONECA Ivo, (postdoctorant)

BURY Stéphanie, (doctorante)

COLLAND Frédéric (Hybrigenics)

CONTRERAS DE CAMACHO Monica, (doctorante)

LALIOUI Lila, (doctorante)

LE FRIEC Sandrine, (DEA)

NGUYEN THI PHUONG Lan (Institut Pasteur Hochi Minh)

O'ROURKE Eyleen (Université de Buenos Aires)

PLANÇON-ARNOULD Laure, (postdoctorante)

SKOULOUBRIS Stéphane, (doctorant)

STAM Mark, (Maîtrise, Paris XI)

USEIN Codruta (Institut Cantacuzène de Bucarest)

Ingénieurs :

CHEVALIER Catherine, Ingénieur d'études INSERM

Techniciens :

DU MERLE Laurence, IP

ECOBICHON Chantal, IP

THIBERGE Jean-Michel, IP

TROUBADOUR Pascale, IP (1/2-poste)


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