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  Strepto


  Responsable : TRIEU-CUOT Patrick (ptrieu@pasteur.fr)


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Notre recherche porte essentiellement sur la caractérisation des facteurs de virulence de Streptocccus agalactiae, un agent majeur des infections néonatales. A cette fin, les techniques de génétique et de biologie cellulaire sont combinées avec l'utilisation d'un modèle murin pour caractériser les gènes impliqués dans la virulence de ce pathogène. Parallèlement à cette recherche, nous étudions la dissémination de la résistance aux antibiotiques dans les entérocoques, les streptocoques et les bactéries apparentées. Enfin, nous avons développé une nouvelle méthode génotypique pour une identification précise au niveau de l'espèce des bactéries à Gram positif (entérocoques, streptocoques, staphylocoques,...) basée sur le séquençage rapide de la cible monocopie du gène sodA.



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Les facteurs de virulence de Streptococcus agalactiae.

S. agalactiae, streptocoque du groupe B de Lancefield (SGB), est un constituant normal de la flore humaine qui colonise les voies respiratoires, digestives et urogénitales. Cette bactérie est la principale cause d'infections (septicémie, méningite et pneumonie) chez le nouveau-né et est également responsable d'infections chez l'adulte, notamment sur terrain fragilisé. Les SGB peuvent être classés en sérotypes sur la base de l'immuno-réactivité de leur capsule polysaccharidique. Parmi les neuf sérotypes capsulaires caractérisés à ce jour, les types Ia, Ib, II, III et V sont responsables de la majorité des infections néonatales à SGB. Le sérotype capsulaire III est particulièrement important car il est fréquemment associé aux infections néonatales précoces qui surviennent au cours de la première semaine après la naissance et est responsable de la majorité des infections néonatales tardives qui surviennent après la première semaine. Ce sérotype est également responsable de la majorité des cas de méningites néonatales dues aux SGB.
La physiopathologie des infections à SGB implique que cette bactérie puisse i) échapper aux défenses immunitaires de l'hôte, ii) adhérer et envahir différents types de cellules épithéliales dont celles constituant l'épithélium pulmonaire et la barrière hémato-méningée et iii) s'adapter rapidement à des conditions de culture très différentes (pH, température, carences nutritives, ...).


1. Contribution de la superoxide dismutase Mn-dépendante (SodA) dans la virulence de S.agalactiae.

Les superoxide dismutases convertissent les superoxides en oxygène et en peroxydes qui, à leur tour, sont métabolisés par les catalases et/ou les peroxydases. Ces enzymes constituent les principaux mécanismes de résistance des cellules au stress oxydatif et, de ce fait, jouent un rôle dans la virulence de certaines bactéries. Nous avons préalablement montré que les SGB synthétisaient une superoxide dismutase Mn-dépendante (SodA) unique. Pour analyser le rôle de cette enzyme dans la virulence des SGB, nous avons construit un mutant SodA- de la souche S. agalactiae NEM316 en inactivant le gène sodA par échange allélique. Ce mutant a été par la suite complémenté par intégration dans le chromosome du vecteur pAT113/Sp qui contenait le gène sodA sauvage. L'étude des activités Sod par analyse électrophorétique d'extraits bactériens a confirmé la présence d'une enzyme active dans les souches sauvages et complémentées mais non dans la souche mutante. En culture aérée, la croissance de la souche mutante était inférieure à celle de la souche sauvage ou complémentée, alors qu'aucune différence de croissance n'était observée en culture non aérée. Par ailleurs, le mutant SodA- présentait une sensibilité accrue à la lyse par des macrophages différentiés à partir de monocytes de moelle osseuse de souris. Dans un modèle d'infection murin, après injection i.v., la survie du mutant SodA- dans le sang et le cerveau était significativement réduite en comparaison de celles des souches sauvages et complémentées alors que peu de différence était observée dans le foie et la rate. Ces résultats suggèrent que la protéine SodA contribue à la virulence des SGB.


2. L'estérification des acides lipotéchoïques chez S. agalactiae est régulée par un nouveau système de régulation à deux composants et contribue à sa virulence.

L'opéron dlt des bactéries à Gram-positif est composé de 4 gènes (dltA, dltB, dltC, et dltD) qui catalysent l'incorporation de résidus D-alanine dans les acides lipotéchoïques (LTAs). Nous avons caractérisé l'opéron dlt de S. agalactiae qui, en plus des gènes dltA-dltD, possèdent 2 gènes régulateurs, désignés dltR et dltS, en amont de dltA. Le gène dltR code pour un régulateur transcriptionnel putatif de 224 acides aminés appartenant à la famille OmpR. Le gène dltS code pour une histidine kinase putative de 395 acides aminés vraisemblablement impliquée dans la captation de signaux environnementaux. L'opéron dlt de S. agalactiae est majoritairement transcrit à partir d'un promoteur PdltR qui dirige la synthèse d'un transcrit de 6,5 kilobases qui chevauche les gènes dltR, dltS, dltA, dltB, dltC et dltD. Nous avons démontré que PdltR était activé dans un mutant DltA- incapable d'incorporer du D-Ala dans les LTAs construit par insertion-inactivation du gène dltA qui code pour une D-alanine-D-alanyl carrier ligase cytoplasmique. Le mutant DltA- présentait la particularité de former des agrégats en culture non agitée et de posséder une sensibilité accrue à la colistine, un peptide antibactérien. Nous avons également montré que l'incorporation de résidus D-Ala dans les LTAs était importante pour la virulence de S. agalactiae puisque, dans un modèle d'infection murin i.v., le mutant DltA- était plus rapidement éliminé du sang, du cerveau, du foie et de la rate que la souche sauvage.
L'élimination rapide du mutant DltA- du sang des souris infectées a été interprétée comme résultant d'une sensibilité accrue à la phagocytose par les polynucléaires neutrophiles et/ou par les macrophages puisque les souches sauvages et mutantes présentent la même sensibilité au sérum en absence d'anticorps anti-SGB. En accord avec cette hypothèse, des résultats préliminaires ont montré que le mutant DltA- était plus sensible à la phagocytose par les macrophages murins que la souche sauvage. Etant donné que les principales modifications phénotypiques observées dues à l'absence de D-Ala dans les LTAs de S. agalactiae étaient une sensibilité accrue au polypeptide cationique colistine, une hypothèse vraisemblable rendant compte de cette observation est que le mutant DltA- serait plus sensible aux défensines que la souche sauvage. Une hypothèse alternative est que ce mutant soit plus sensible aux conditions (pH et stress oxydatif) rencontrées dans le phagolysozome.


3. Analyse structurale et fonctionnelle du génome de S. agalactiae (En collaboration avec les Dr F. KUNST et Dr P. GLASER, Laboratoire de Séquençage des Micro-organismes Pathogènes, Institut Pasteur et avec le Dr T. MSADEK, Unité de Biochimie Microbienne, Institut Pasteur).
Ce programme de recherche a été conçu afin de valoriser au mieux la connaissance du génome de S. agalactiae, actuellement déterminé par F. KUNST et P. GLASER à l'Institut Pasteur. Les 4 principaux objectifs poursuivis (résistance au stress oxydatif, protéines de surface, adaptation environnementale et expression de gènes de virulence) ont été choisis parce qu'ils constituent des éléments clefs pour la compréhension de la physiopathologie des infections à SGB et pour la caractérisation du ou des gène(s) impliqué(s) dans le franchissement de la barrière hémato-méningée. De plus, leur élucidation devrait permettre de proposer de nouvelles cibles pour de nouvelles stratégies thérapeutiques et, notamment, pour le développement de vaccins.


Une nouvelle méthode génotypique permettant l'identification des cocci à Gram positif au niveau de l'espèce

De nombreuses méthodes génotypiques utilisant l'analyse de produits d'amplification génique issus de gènes cibles ont été développées pour identifier les bactéries au niveau de l'espèce. Ces techniques incluent le séquençage de l'ADNr 16S qui est souvent considéré comme méthode de référence. Dans ce dernier cas, cependant, l'analyse des données de séquence peut être compliquée par le fait que des espèces proches peuvent posséder des séquences d'ADNr 16S identiques ou, au contraire, que des séquences d'ADNr 16S différentes peuvent coexister dans une bactérie donnée. Pour résoudre ce problème, il est possible d'utiliser des séquences cibles monocopies qui possèdent une divergence évolutive supérieure à celle de l'ADNr 16S. Le gène sodA des cocci à Gram positif, qui code pour une superoxide dismutase Mn-dépendante, satisfait à ces critères et nous avons montré que le séquençage d'un fragment interne, sodAint, obtenu par PCR à l'aide d'une paire d'amorces dégénérées permettait l'identification fiable au niveau de l'espèce des streptocoques et des entérocoques. Nous avons récemment utilisé la même paire d'amorces universelles pour construire une génothèque de fragments sodAint correspondant à toutes les espèces de staphylocoques à coagulase-négative (SCN) décrites à ce jour et montré que son utilisation permettait l'identification rapide et fiable d'isolats cliniques de SCN. Les génothèques sodAint pourraient être utilisées pour le développement d'un test d'identification bactérien rapide utilisant la technologie des puces à ADN.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
   

TRIEU-CUOT, Patrick (IP)

POYART, Claire (Necker)

de BARROS NASCIMENTO BAPTISTA, Marina (Chercheur post-doctorant)

LALIOUI, Lila (Chercheur post-doctorant)

LAMY, Marie-Cécile (Thèse sciences)

 

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