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  Responsable : KOLB, Annie (akolb@pasteur.fr)


  resume

 

Par des approches biochimiques et génétiques, nous étudions les mécanismes par lesquels deux ARN polymérases de structure très voisine, l'une contenant le facteur smajeur s70 et l'autre le facteur sS de phase stationnaire, contrôlent l'expression de gènes différents chez E. coli. Des régulateurs transcriptionnels comme le complexe CRP-AMP cyclique et des protéines anti-s jouent un rôle crucial dans la spécificité de reconnaissance de différents promoteurs par ces deux ARN polymérases



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Le démarrage de la transcription est une étape cruciale pour la régulation de l'expression génétique ; chez E.coli il est assuré par l'ARN polymérase holoenzyme, composée de l'enzyme-coeur E associé à une sous-unité s.

Comparaison des ARN polymérases de phase exponentielle et de phase stationnaire et étude de promoteurs de phase stationnaire (Sandrine Anne, Denise Kotlarz et Olivier Leroy).

Un des thèmes majeurs de notre laboratoire est l'étude des mécanismes par lesquels les deux ARN polymérases majeures d'E. coli , Es70 et EsS reconnaissent des classes distinctes de promoteurs. Alors que s70 est exprimé de manière constitutive, sS est induit seulement en réponse à certains stress et à l'entrée en phase stationnaire ; il reste toujours 3 fois moins abondant que s70. Le régulon sS comprend environ une centaine de gènes impliqués dans la protection de la bactéries contre différents types de stress, la survie en phase stationnaire et le contrôle de la virulence. sS est très homologue à s70, en particulier dans les domaines qui se lient au promoteur. Aussi un grand nombre de promoteurs sont-ils reconnus in vitro par les deux formes d'ARN polymérases, mais avec des affinités et des cinétiques différentes. Les promoteurs qui dépendent de sS sont en général des promoteurs faibles; la plupart sont dépourvus d'hexamère -35 consensus mais possèdent souvent un C en position -13 en amont de la boîte -10. Les mutations qui rapprochent le promoteur de la séquence consensus de s70 sont susceptibles de le faire passer sous le contrôle de s70in vivo.
Pour définir les paramètres qui déterminent la sélectivité de reconnaissance des promoteurs, nous avons entrepris une comparaison systématique entre les deux ARN polymérases. In vitro , sS a une affinité plus faible pour l'enzyme-coeur mais les deux holoenzymes présentent des structures peu différentes et les complexes ouverts formés par EsS au promoteur se révèlent très similaires à ceux formés avec Es70, avec cependant un ancrage plus faible de sS au niveau de la région -35. Les deux ARN polymérases présentent des réponses différentes au niveau du surenroulement de l'ADN ; la réduction du taux de surenroulement favorise pour de nombreux promoteurs la transcription dépendant de sS aux dépens de celle dépendant de s70.
La plupart des gènes du régulon sS sont soumis à de multiples régulations et de nombreuses protéines se lient à l'ADN des promoteurs dépendant de sS. Activateurs et répresseurs sont capables d'affecter différentiellement la fixation des deux holoenzymes selon leur positionnement sur le promoteur et donc de jouer un rôle crucial dans la sélectivité de reconnaissance. Les régulateurs globaux les plus couramment impliqués dans la discrimination entre les deux ARN polymérases sont le complexe CRP-AMP cyclique, les protéines Lrp, IHF et HNS.
Tous les promoteurs induits en phase stationnaire ne dépendent pas de sS. En collaboration avec le Pr. Garcia (CSIC-Madrid), Beatriz Galan a étudié la régulation du promoteur hpaB , responsable du catabolisme de l'acide hydroxyphénylacétique chez E. coli W. Même en présence de l'inducteur, ce promoteur n'est exprimé qu'après disparition complète du glucose à l'entrée en phase stationnaire sous la dépendance du complexe CRP-AMP cyclique et de IHF.


Inhibition de promoteurs dépendants de sigma54 par le complexe CRP-AMP cyclique (collaboration avec le Pr. Yiping Wang de l'Université de Pékin)

Le complexe CRP-AMP cyclique apparaît comme un activateur proximal de nombreux promoteurs chez E. coli ; il interagit par des contacts protéine-protéine avec la partie C-terminale de la sous-unité alpha de l'ARN polymérase et " recrute " l'ARN polymérase au promoteur. L'activation a lieu avec différentes formes d'ARN polymérases Es70, mais aussi EsS et E s32 , mais non avec Es54. Pour former le complexe ouvert, Es54 requiert en effet la présence d'un activateur transcriptionnel comme NtrC capable d'hydrolyser un ribonucléoside triphosphate et qui se fixe souvent à de grandes distances du promoteur.
Le complexe CRP-AMP cyclique exerce un effet inhibiteur sur les promoteurs dépendants de sigma54: ainsi le promoteur glnAP2 qui est activé par la forme phosphorylée de NtrC en conditions de carence en azote présente une expression dépendante de la source de carbone utilisé, 4 fois plus faible en glycérol qu'en glucose. L'effet inhibiteur de CRP-AMP cyclique s'exerce au niveau transcriptionnel et ne dépend ni de l'activateur utilisé, ni de la présence de sites CRP en amont du promoteur.


Modulation de l'activité des promoteurs par le facteur anti-sigma AsiA (Gilbert Orsini)

La concentration et l'activité des facteurs s sont aussi contrôlées par des facteurs anti-s qui en général empêchent spécifiquement l'association d'un facteur s avec l'enzyme-coeur. La protéine AsiA, facteur anti-s du bactériophage T4 possède cependant un mode d'action différent. Dans l'holoenzyme Es70, AsiA se lie fortement à la région 4.2 de s70 et présente une double activité. D'une part, AsiA inhibe le démarrage de la transcription à partir de promoteurs possédant un motif -35 consensus comme les promoteurs bactériens ou précoces du phage T4. D'autre part, AsiA coopère avec la protéine Mot A, l'activateur transcriptionnel des promoteurs des gènes moyens du phage T4, pour réorienter l'activité de la polymérase des promoteurs précoces vers les promoteurs moyens du phage. Pour mieux comprendre le mécanisme de la répression exercée par AsiA, nous avons étudié en présence de glutamate de potassium le comportement du complexe ARN polymérase/AsiA à l'égard de lacUV5, exemple classique d'un promoteur à motif -10/-35. Dans ces conditions de sel couramment utilisées dans le domaine de la transcription, l'inhibition par AsiA est fortement diminuée. L'activité transcriptionnelle qui est observée est due à la lente transformation du complexe ternaire Es70/AsiA/lacUV5 en un complexe ouvert et actif. L'affinité de l'enzyme pour le promoteur est 10 fois plus faible dans le complexe ternaire que dans le complexe binaire Es70 /lacUV5. Par analyse cinétique de la transcription abortive, on peut montrer que la présence d'AsiA dans l'holoenzyme diminue de 120 fois la constante de vitesse globale de deuxième ordre pour l'association de l'holoenzyme et lacUV5, avec en particulier, une diminution de 55 fois de la constante de vitesse de l'étape d'isomérisation aboutissant au complexe ouvert. Le complexe ternaire et actif est sensible à l'activation par le complexe cAMP-CRP, indiquant des interactions fonctionnelles entre la protéine CRP et le domaine C-terminal des sous-unités a de l'holoenzyme. Nous avons montré que des contacts compensatoires Es70 /région amont du promoteur mettent en jeu le domaine C-terminal des sous-unités a de l'holoenzyme et sont requis pour permettre l'association entre Es70et le promoteur lacUV5.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Odile Delpech

Gilbert Orsini (Maître de Conférences Paris VII)

Olivier Leroy (étudiant DEA)

Beatriz Galan (étudiante thèse)

Yiping Wang (Professeur invité de l'Université de Pékin)

Béatrice Martin

Sandrine Anne

Denise Kotlarz


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