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  Responsable : Antoine Danchin (adanchin@pasteur.fr)


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L'Unité explore au moyen des techniques de la génomique la façon dont le texte du génome organise l'expression des gènes, et en particulier l'architecture de la cellule. Deux modèles bactériens servent à cette exploration, le colibacille, et le bacille subtil. Les recherches développées associent l'étude à l'ordinateur des séquences génomiques (analyse in silico) et la validation des prédictions ainsi obtenues in vivo et in vitro. Les objets privilégiés de cette étude contrôlent l'expression d'un grand nombre de gènes (le métabolisme du soufre en particulier) et sont pour cette raison spécialement importants pour comprendre le caractère pathogène des bactéries.



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Une nouvelle Pierre de Rosette : comparer le texte de génomes apparentés

Pour la dernière année de son activité, l'Unité de Régulation de l'Expression Génétique a commencé à développer l'étude comparative de deux couples de génomes, chacun constitué du génome d'une bactérie de référence et d'une bactérie intéressante comme modèle de maladies. Après s'être consacrée à l'établissement du texte génomique de Bacillus subtilis, et à la gestion des connaissances correspondantes, l'Unité a terminé son activité. Elle a servi de base à la création d'une nouvelle Unité de Recherche, dont l'activité est fondée sur les techniques d'exploration des génomes à grande échelle, l'Unité de Génétique des Génomes Bactériens. Cette nouvelle Unité est étroitement associée à la création avec l'Université de Hong Kong (Chine), du HKU-Pasteur Research Centre.

Deux micro-organismes modèles ont été utilisés : Escherichia coli, le plus ancien modèle des généticiens et la bactérie la mieux connue, et Bacillus subtilis, bactérie source de nombreux enzymes utilisés en industrie, que l'on trouve souvent collée à la surface des feuilles et sur le sol. Ces bactéries sont comparées respectivement à Photorhabdus luminescens, qui tue les insectes et se propage par l'intermédiaire d'un ver nématode, et Bacillus cereus, bactérie sporulante impliquée dans de nombreuses maladies et dont l'un des voisins est le dangereux agent du charbon. L'étude porte sur l'identification et la fonction de gènes pivots de l'adaptation globale de la bactérie à son environnement.


La protéine H-NS et la réponse aux transitions métaboliques (Philippe Bertin)

La capacité d'ajuster la disponibilité et l'activité des protéines cellulaires, en particulier les protéines de régulation et les enzymes du métabolisme, est essentielle pour permettre la croissance des cellules et leur adaptation aux changements de l'environnement. La protéine H-NS est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires et affecte l'expression de gènes régulés par des facteurs de l'environnement (température, pH, osmolarité, ...). Elle modifie l'expression de nombreux gènes, affecte la recombinaison et la transposition et intervient dans la virulence bactérienne, par le contrôle de la motilité en particulier.

L'examen des souches sauvage et mutante en microscopie électronique a révélé que cette perte de motilité résulte d'une absence de flagelles. Leur synthèse requiert l'expression d'un grand nombre de gènes, organisée de manière hiérarchique. La surexpression dans un mutant hns des gènes flhDC, l'opéron maître de biosynthèse des flagelles, restaure la motilité, ce qui suggère que ces gènes constituent la cible préférentielle d'H-NS. Un travail antérieur a montré que la synthèse ou l'accumulation de plusieurs protéines est affecté spécifiquement par la mutation hns. Nous avons par conséquent entrepris, en collaboration avec C. Laurent-Winter (Génopôle, Institut Pasteur), de caractériser ces protéines dont la synthèse est spécifiquement affectée par H-NS et de faire l'inventaire des protéines ainsi régulées. Plusieurs de ces protéines ont été identifiées, soit par microséquençage, soit par superposition aux cartes de références 2D des protéines d'E. coli. Certaines correspondent à des cibles déjà connues d'H-NS (GadA, OmpF, OmpC, ProX). D'autres protéines dont la synthèse ou l'accumulation sont affectées dans un mutant hns sont impliquées dans des mécanismes aussi divers que la composition de la paroi cellulaire, les processus de transport, le métabolisme des hydrates de carbone, ou la réponse bactérienne à diverses conditions de l'environnement. En particulier, la synthèse de plusieurs protéines de choc thermique dont trois chaperones (DnaK, GroEL et GrpE) est induite dans le mutant hns.

Un travail complémentaire, en collaboration avec J.P. Le Caer (Laboratoire de Neurobiologie et Diversité Cellulaire dirigé par J. Rossier, ESPCI de Paris) a permis d'identifier d'autres protéines dont la synthèse ou l'accumulation est spécifiquement affectée par une mutation hns. Ce travail a utilisé une importante amélioration technique où les gels 2D sont colorés au nitrate d'argent. Cette coloration est en effet 100 fois plus sensible que celle qui est généralement utilisée (bleu de Coomassie). De plus, elle est compatible avec l'identification des peptides par spectrométrie de masse. La comparaison des profils électrophorétiques des souches sauvage et mutante a montré que le niveau d'accumulation de plus de 60 protéines, dont près de la moitié ont été identifiées, était affecté dans un mutant hns.

L'analyse de l'ensemble des produits de la transcription (transcriptome), associée à celle de toutes les protéines de la bactérie séparées par électrophorèse à deux dimensions (protéome), a été conduite en parallèle en utilisant la séquence des génomes correspondants.

Ces méthodes très puissantes ont mis au jour de grands ensembles régulés (le régulon H-NS compte plus de 250 gènes) de la même manière dans la cellule.

Ces études ont été complétées par des analyses phylogénétiques (évolution de la protéine), et structurales de plusieurs protéines identifiées dans divers organismes.


L'édification des acides aminés contenant du soufre (Isabelle Martin-Verstraete)

Comme on le verra plus bas un travail in silico a mis en évidence un rôle organisateur partiulier des gènes du métabolisme du soufre. Cela a justifié le démarrage d'un programme de recherche sur ce métabolisme et celui des polyamines, composés essentiels à la construction cellulaire. Très peu de données sont connues chez les bactéries à Gram-positif concernant les voies de biosynthèse des acides aminés contenant du soufre (méthionine et cystéine), aussi bien que les voies d'assimilation des sources de soufre ou la régulation du métabolisme correspondant. Le travail de l'Unité a donc d'abord porté sur la caractérisation de gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de la méthionine et la cystéine chez Bacillus subtilis. En dehors de la caractérisation explicite de nombreux gènes, cette étude a permis d'ajouter quelques éléments à la validation d'une hypothèse sur l'évolution moléculaire des voies métaboliques qui suppose que la spécification progressive des activités enzymatiques se fait au cours de l'évolution à partir d'une activité primaire peu spécifique. Cette étude a été complétée, comme dans le cas de l'étude de H-NS, par l'analyse du profil d'expression protéique (analyse du protéome par gels bidimensionnels) et du profil de transcription par hybridation sur membranes (analyse du transcriptome). Ces analyses complémentaires l'une à l'autre ont mis en évidence un rôle essentiel du métabolisme du soufre (ce qui justifie pleinement le choix de ce thème comme central à l'approche génomique) et ont permis d'identifier un certain nombre d'ensembles co-régulés. Plusieurs gènes de fonction inconnue vraisemblablement impliqués dans le métabolisme du soufre ont ainsi pu être identifiés dont plusieurs transporteurs. Les travaux de l'Unité se sont aussi consacrés à l'identification de gènes de régulation essentiels pour le métabolisme du soufre. Plusieurs d'entre eux ont été caractérisés. Ils diffèrent notablement de ce qui était déjà connu chez les bactéries à coloration de Gram négative comme Escherichia coli, ce qui donne un sens particulièrement intéressant à cette étude.

L'ensemble de ces travaux fait partie du programme BACELL d'analyse fonctionnelle détaillée du génome de Bacillus subtilis financé par l'Union Européenne.


La dégradation des composés aromatiques, le fer, et l'oxygène (Francis Biville)

Le catabolisme des molécules aromatiques joue un rôle clé chez de nombreux organismes. Il est d'autant plus intéressant qu'il utilise en général l'oxygène (souvent sous la forme de molécule de dioxygène) et qu'il participe donc explicitement au contrôle de la concentration intracellulaire de ce gaz extrêment réactif. Les travaux de l'Unité ont permis, il y a quelques années de caractériser une dioxygénase dont la régulation paraît importante du fait qu'elle est couplée à l'expression d'un grand nombre de gènes (en particulier via l'activateur HcaR). La séquence peptidique de cette enzyme est, de façon remarquable, est très voisine d'une enzyme essentielle à l'apoptose dans les cellules animales. À l'aide des méthodes d'analyse informatique, de génétique, de physiologie et d'analyse globale (protéome, transcriptome), les travaux de l'Unité ont permis d'identifier des cibles de deux régulateurs structurellement voisins (les activateurs hcaR et yhaJ) dont le niveau d'expression était augmenté au cours de l'entrée en phase stationnaire. L'inactivation de hcaR affecte de façon significative le niveau d'expression de sept gènes impliqués dans la réponse à l'oxygène. Cet effet se traduit par une forte diminution de la résistance à certains dérivés réactifs de l'oxygène au cours de la phase stationnaire. Le produit du gène hcaR est aussi un régulateur impliqué dans le contrôle des premières étapes du catabolisme de l acide 3-phénylpropionique. L'étude des perturbations du métabolisme, créées par l'entrée en phase stationnaire par l'inactivation de hcaR est en cours. Les résultats obtenus avec le régulateur yhaJ montrent que la surexpression de ce gène entraîne une altération du processus de division cellulaire. L'identification des cibles de ce régulateur, impliquées dans ce phénotype, est en cours. Un troisième régulateur inconnu de type LysR (ygiP) a été identifié comme le régulateur positif de gènes voisins codant pour une activité nécessaire à la croissance sur glycérol et anaérobiose. La méthode d'analyse comparative des transcriptomes a permis de proposer l'hypothèse selon laquelle cet activateur modulerait l'expression de gènes impliqués dans la mobilité et sa régulation, le transport du fer et le stress acide. Les résultats d'expériences de physiologie ont montré que l'inactivation de ygiP entraîne une très forte accélération de la formation des biofilms et confirme ainsi les données de transcriptome relatives à l'action de ce régulateur sur la régulation de la biosynthèse des flagelles.
Ces travaux vont contribuer à l'identification des cibles d'autres gènes activateurs inconnus de la famille LysR et permettre de comprendre leur mode d'action et de mieux définir leurs cibles au niveau de l'ADN.


L'annotation, la gestion des connaissance et l'analyse des données in silico (Ivan Moszer, Eduardo Rocha Paris, Claudine Médigue, Evry)

En raison de la masse très importante de données engendrées par le séquençage des génomes et de la nature énigmatique de beaucoup de gènes découverts à cette occasion, les études expérimentales développées en utilisant les techniques de la génétique moléculaire sont complétées par un ensemble de recherches utilisant les techniques et les concepts de l'informatique, de la statistique et de la mathématique. Une base de données spécialisée sur le génome de Bacillus subtilis, servant de modèle à plusieurs autres, a été construite (elle est accessible par le World-Wide Web à l' adresse : http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ ). Elle est actuellement enrichie, tant en terme de schéma conceptuel que de données, par les résultats d'analyse du transcriptome issus du programme européen BACELL Network. Par ailleurs une plateforme d'annotation génomique, Imagene, a servi à établir un modèle général d'identification des erreurs dans les séquences génomiques, donnant lieu à une mise à jour majeure de la séquence et des annotations du génome de B. subtilis. Le projet correspondant est développé au sein d'un consortium (Geno*) qui associe l'Unité, un laboratoire de l'INRIA, et les compagnies Hybrigenics et GENOME express. L'aspect plus biologique et naturaliste des recherches vise à identifier le lien entre les grandes fonctions du vivant et l'architecture cellulaire. L'analyse des génomes a montré que l'ordre des gènes dans le chromosome n'est pas aléatoire, mais correspond à l'architecture de la cellule. L'étude du métabolisme du soufre a permis de proposer que la pression de sélection qui a conduit à ce lien inattendu est sans doute la diffusion de molécules réactives, gaz et radicaux libres. Ces réactions sont dues au produit de nombreux gènes dont la fonction était restée jusqu'à présent incomprise. Ainsi la compartimentation cellulaire est-elle à l'origine d'une caractéristique des gènomes qui avait beaucoup surpris au moment de sa découverte, à savoir la présence de nombreux gènes sans fonctionconnue.



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

Annie Beaudeux-Ligneul, Secrétaire ID Pasteur

Pr Antoine Danchin, Chef d’Unité Pasteur, DR1 CNRS

Philippe Bertin, C.R Pasteur

Francis Biville, C.R Pasteur

Isabelle Martin-Verstraete, M.C Paris 7

Claudine Médigue-Rousseau, CR CNRS

Ivan Moszer, CR Pasteur

Eduardo Pimentel Cachapuz Rocha, CR CNRS

Isabelle Guillouard, Post-doc, AR (CDD Contrat Européen)

Sylvianne Derzelle, Post-doc (CDD Contrat Industrie)

Sandrine Auger, 2ème année de thèse, Univ. Paris 7

Florence Hommais, 3ème année de thèse, Univ. Paris 7

Sandrine Moreira, 2ème année DESS Informatique

Olga Soutourina, 3ème année de thèse, Univ. Versailles

Cécilia Fabry, IE INRA

Evelyne Krin, I CNRS

Evelyne Turlin, TS Pasteur

Saravuth NGO, AI, CDD

Emma Brito, Technicienne de Laboratoire

Laurence Maranghi, Aide de Laboratoire


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