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  Responsable : Michel VERON (mveron@pasteur.fr)


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Les thématiques du laboratoire sont: Etude du rôle de la NDP kinase dans la phoshorylation des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-HIV. Etude de l'interaction de la NDP kinase humaine de type B avec l'ADN simple brin et de son rôle dans la régulation de la transcription de l'oncogène c-myc. Etude des propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kB. Etude de la protéine kinase dépendante de l'AMPc chez Dictyostelium et chez plasmodium falciparum. Etude de la recombinaison chez les rétrovirus in vitro.



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Mécanisme catalytique de la NDP kinase Benoit schneider et Dominique deville-bonne

La Nucléoside Diphosphate Kinase (NDP kinase) échange un phosphate entre nucléosides triphosphates et diphosphates. La réaction catalytique de type ping-pong implique un intermédiaire enzymatique phosphorylé transitoirement sur une histidine. La fonction 3'-OH du ribose du nucléotide substrat est impliqué dans le mécanisme réactionel qui est de type "assisté par le substrat".
Nous étudions le mécanisme catalytique en utilisant des enzymes mutées sur des résidus du site actif. Les mutants H122G et H122A de la NDP kinase de Dictyostelium n'ont plus d'activité NDP kinase mais ils catalysent la synthèse d'imidazole-phosphate à partir d'ATP et d'un nucléophile exogène comme l'imidazole (collaboration D. Herschlag, Standford, USA). Par ailleurs, l'état d'ionisation de deux résidus importants dans le transfert de phosphate (Lys 16 et Tyr 56) a été étudié. Dans l'enzyme sauvage, les deux résidus, protonés dans la forme active de l'enzyme, sont en interaction alors que dans le mutant K16A, la Tyr56 présente un pK anormal. Cependant, le remplacement de ces résidus dits "catalytiques" entraîne une diminution d'activité plus faible que l'absence du 3'OH du nucléotide. Récemment, nous avons synthétisé un analogue stable de l'enzyme phosphorylé en modifiant chimiquement le mutant inactif H122C. Cette forme pseudophosphorylée présente une plus grande affinité pour les NDP que pour les NTP.



Phoshorylation in vitro des analogues de nucléotides utilisés dans les thérapies anti-SIDA par la NDP kinase Benoit schneider, Sarah gallois-montbrun, Annett Kreimeyer et Dominique deville-bonne

Malgré l'apparition de nouveaux inhibiteurs, les analogues de nucléotides substitués sur la position 3' du ribose comme l'AZT restent indispensables dans tous les protocoles thérapeutiques contre le SIDA. Ils sont toujours donnés aux malades sous forme de nucléosides, molécule non chargée qui peut traverser la membrane plasmique. Les analogues sont phosphorylés en dérivés triphosphates par plusieurs kinases cellulaires pour agir comme terminateurs de chaines au niveau de la transcriptase inverse. La NDP kinase est responsable de la dernière étape de cette voie d'activation.
Nous étudions la réactivité de la NDP kinase humaine recombinante au niveau biochimique et structural avec plusieurs analogues actuellement utilisés en thérapie anti-VIH (ddI, ddC, AZT, d4T) (en collaboration avec L. Mulard, Unité de Chimie Organique de l'Institut Pasteur pour la synthèse des analogues de nucléotides phosphorylés et avec le laboratoire de J. janin, LEBS à Gif-sur-Yvette, pour les études structurales par cristallographie des rayons X). Par des études à l'état préstationnaire, nous avons montré que la phosphorylation des dérivés diphosphate des analogues est beaucoup moins efficace que pour les nucléotides naturels, ce qui fait de la réaction catalysée par la NDP kinase une étape limitante dans leur activation. Nous avons déterminé les constantes cinétiques et les constantes de fixation de ces différents analogues. La combinaison des études biochimiques et des structures des complexes a permis de proposer un modèle mécanistique précis de la phosphorylation de ces agents thérapeutiques par la NDP kinase.
Le 3TC est un dérivé de configuration -L de la thiacytidine utilisé depuis récemment en thérapie contre le SIDA et l'hépatite B et des b-L-désoxynucléosides (b-L-thymidine et la b-L-2'-désoxycytidine) ont été reconnus récemment comme des agents spécifiques anti-hépatite B. La réactivité des nucléotides et désoxy nucléotides de configuration -L avec la NDP kinase humaine est très réduite, en particulier pour le 3TC (collaboration avec A. Faraj et J.P. Sommadossi (Laboratoire NOVORIO-CNRS et Université Montpellier II). Ces résultats suggèrent que d'autres kinases, actuellement inconnues, assurent la formation des L-dXTP au sein de la cellule.
La ribavirine, analogue de guanosine, est le seul analogue de nucléoside utilisé contre les virus à ARN positifs et elle pourrait constituer un médicament contre le virus de la dengue, responsable de fièvres hémorragiques. Elle est active au niveau cellulaire sous forme triphosphate. Nous voulons améliorer l'efficacité de la ribavirine en identifiant un analogue qui soit actif à faible dose et qui génère moins de cytotoxicité. Plusieur sdérivés diphhosphates de la ribavirine sont en cours d'analyse pour leurs propriétés d'activation par la NDP kinase en molécule triphosphorylée et pour leur affinité vis à vis de leur cible potentielle, la protéine de coiffe virale (collaboration avec L.Mulard, Unité de Chimie Organique, Institut Pasteur et avec B. Canard, ESIL,CRNS, Marseille).


Mise au point de nouveaux analogues et de variants de la NDP kinase à capacité de phosphorylation accrueBenoit schneider, Véronique Giaccomoni-fernandez, Céline boulard, Dominique deville-bonne

Nous avons conçu de nouveaux inhibiteurs de la transcriptase inverse par introduction d'un groupe borano (BH3) sur l'a-phosphate du nucléoside (collaboration avec S. Sarfati et L Mulard, Unité de Chimie Organique, Institut Pasteur). Les propriétés biochimiques des dérivés boronates de l'AZT et du d4T ont été caractérisés in vitro sur la NDP kinase et la transcriptase inverse. La structure cristallographique des complexes NDP kinase/analogue permet de comprendre la meilleure réactivité des dérivés avec les deux protéines. Leur efficacité au niveau cellulaire est en cours d'étude (collaboration avec P. Clayette, CEA).
Dans une approche d'ingénierie des protéines, nous cherchons à modifier la NDP kinase au niveau de son site actif pour qu'elle devienne un meilleur agent de conversion des pro-drogues nucléosidiques en nucléotides au sein des cellules infectées. Un mutant a été obtenu qui phosphoryle le d4T et l'AZT avec des constantes cinétiques augmentées d'un facteur >10 par rapport à la protéine sauvage. Les essais en cours cherchent à déterminer si des cellules exprimant cette protéine mutante ont un niveau de dérivé tri-phosphate et une susceptibilité aux différentes drogues augmentées.


Etude de la recombinaison in vitro chez les rétrovirusAbdeladim Moumen, Lucette POLOMACK, Matteo Negroni, Henri BUC
(NB: H. Buc est Professeur émérite rattaché à l'URA 1960 du CNRS)

La recombinaison constitue une des sources principales de variabilité génétique chez les rétrovirus. Chez ces virus, la pluparrt des recombinaisons sont générées par l'échange de matrice, pendant la transcription inverse, entre les deux copies du RNA génomique présentes dans la particule virale. Ce processus est appellé " échange de brin" ou "choix de copie". L'importance de la recombinaison dans la dynamique de l'infection par les retrovirus a été illustrée par l'expansion de la pandémie de SIDA où au moins 10% des souches infectieuses ont pour origine une recombinaison entre des subtypes viraux.
Nous étudions le mécanisme de recombinaison in vitro dans un système reconstitué en utilisant des éléments (protéines et acides nucléiques) purifiés. Nous nous intéressons en particulier au rôle des structures secondaires des ARNs génomiques dont nous avons récemment suggéré qu'elles constituent un paramètre crucial dans le processus de recomninaison. La nucléocapside, une protéine constituant un élément important du complexe de transcription, connue pour augmenter la fréquence de recombinaison in vitro, possède une activivité de chaperone d'ARN. Nos résultats démontrent que la structure de l'ARN génomique joue également un rôle important dans l'échange de brin. Les expériences en cours ont pour but de définir les déterminants structuraux des matrices ARN et de la transcriptase inverse impliqués dans le processus.


Interaction de la NDP kinase humaine de type B avec l'ADN simple brinSharona Raveh, Fei WE et Fabrice Agou

L'une des isoformes de la NDP kinase humaine (la NDPK-B) participe à la régulation de l'expression de l'oncogène c-myc. En utilisant la protéine recombinante et des oligonucléotides synthétiques, nous avons montré que la NDPK-B se fixe sur l'ADN simple brin sans spécificité de séquence. La NDPK-A, un isozyme identique à 88%, ne se fixe pas, ce qui montre que l'interaction est spécifique. En utilisant une technique de pontage par laser UV couplée à l'analyse de peptides par spectrographie de masse MALDI-TOF, nous avons identifié les déterminants structuraux impliqués dans les contacts protéine/ADN (collaboration avec J. Rossier, Ecole de Physique et Chimie de Paris). Par pontage in vivo avec un réactif bifonctionnel réagissant avec les résidus cystéine, nous avons étudié quelle est la forme oligomérique de la NDPK-B (dimère ou hexamère) qui se fixe à l'ADN dans le noyau des cellules. La NDPK-B apparaît comme un facteur de transcription "architectural" interagissant avec des séquences d'ADN simple-brin formées dans des régions de l'ADN formant des triplex ou des quadruplex. Un modèle structural a été élaboré et testé par mutagénèse dirigée.


Propriétés biochimiques de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-kBFabrice Agou et Stephane Goffinont

NEMO (NF-kB Essential MOdulator) est une protéine récemment découverte qui joue un rôle crucial dans la voie de transduction NF-kB, entre la perception des signaux au niveau de la membrane et l'activation des kinases spécifiques de la cascade NF-kB proprement dite.
Nous avons obtenu la protéine NEMO recombinante purifiée en présence de détergents non-ioniques et étudié sa structure quaternaire. Le clonage et la purification d'un fragment correspondant à une partie du domaine C-terminal a permis d'établir que l'association de la protéine en dimères et trimères est dû à une séquence formant des structures en "coiled-coil". L'association de la protéine recombinante avec la protéine chaperon de E. coli DnaK (Hsp 70) suggère un rôle pour ce type de protéines dans l'association de NEMO en oligomères in vivo. L'existence de formes dimériques et trimériques in vivo a également été démontrée dans des lignées de cellules en culture. Ces résultats prennent tout leur sens dans le contexte de la récente découverte que des mutations dans le gène de NEMO sont la cause de plusieurs pathologies humaines (collaboration avec A. Israël, Unité de Biologie Moléculaire de l'Expression Génique, Institut Pasteur).


La protéine kinase dépendante de l'AMPc chez Dictyostelium et chez plasmodium falciparumFrançois Traincart

Les amibes de Dictyostelium discoideum s'engagent dans un cycle de différenciation quand elles sont privées d'apport nutritif. Après quelques heures, elles migrent en réponse à des signaux d'AMPc pour former un "agrégat" multicellulaire. Les cellules se différencient alors et s'organisent en une forme fructifère formée d'une tige supportant une masse de spores.
En collaboration avec Carmen Buchrieser (Laboratoire de Génomique des microorganismes pathogènes, Institut Pasteur), nous avons participé au projet du séquençage du génome de Dictyostelium et en particulier au séquençage de 4 clonesYAC couvrant une partie du chromosome 6. Ce projet est coordoné par le Sanger Center (Hinxton, UK) dans le cadre d'un projet de l'Union Européenne.
Nous avons montré que la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) joue un rôle central dans le développement de Dictyostelium. Les derniers acides aminés de l'extrémité C-terminale de la sous-unité catalytique sont indispensables à l'activité enzymatique. Cette région diverge fortement entre PKAs de mammifères et PKAs d'eucaryotes pathogènes chez certains desquels la PKA est une cible thérapeutique potentielle comme chez Plasmodium falciparum où nous avons mis en évidence une activité PKA indispensable à la maturation des parasites (collaboration avec G. Langsley, Unité de Signalisation Immunoparasitaire, Institut Pasteur). Des anticorps dirigés contre un peptide mimant l'extrémité C-terminale la PKA de Dictyostelium sont de très bons inhibiteurs de la PKA de l'amibe à l'exception de toute autre PKA. Cette séquence est donc susceptible d'être utilisée pour générer des inhibiteurs de PKA hautement spécifiques.
Des résultats préliminaires d'immunofluorescence indiquent que la NDP kinase cytosolique de Dictyostelium est enrichie au niveau de structures submembranaires. Les études enc ours cherchent à déterminer son rôle éventuel dans la réorganisation du cytosquelette en tirant parti des outils biochimiques et génétiques disponibles chez Dictyostelium.
Par ailleurs, nous avons débuté une collaboration avec des professeurs de lycées pour utiliser Dictyostelium comme support de travaux pratiques dans des classes terminales. Les premiers résultats sont très encourageants et des essais vont être étendus avec des protocoles adaptés dans d'autres classes y compris à l'école primaire.

Un senseur à l'AMPc utilisant la sous-unité R de la PKA de Dictyostelium Benoit schneider

Une protéine fusion entre la sous-unité régulatrice (R) de la PKA de Dictyostelium et la GFP a été construite par insertion au hasard de la GFP dans la séquence codante de la sous-unité R. La protéine fusion a été sélectionnée pour ses propriétés de fixation de l'AMPc et d'inhibition de la sous-unité C. Un transfert d'energie de fluorescence (FRET) est obtenu entre la GFP et un dérivé fluorescent du GMPc lié au site de fixation de l'AMPc de la sous-unité R. Par compétition, ce "senseur" pourrait être utilisé pour mesurer les concentrations d'AMPc dans des extraits cellulaires (collaboration avec C. Reymond, Université de Lausanne).


Etude de la protéine CheY de E. coliSandra Da-RE, Jeff Stock, Dominique deville-Bonne

La chimiotaxie chez les bactéries est contrôlée par des "système à deux composants" qui impliquent des cascades de phosphorylation par des histidine-protéines kinases. Chez E. coli , la protéine CheY joue le rôle de " régulateur de réponse " en étant phosphorylée sur un résidu aspartate par l'histidine-kinase CheA. Che Y peut aussi être phosphorylée par de petites molécules donneurs de phosphate comme l'acétylphosphate ou le phosphoramidate. Dans des expériences de mélange rapide, nous étudions la phosphorylation de CheY ou de mutants de CheY par ces petites molécules en tant que modèle du phospho-transfert (collaboration avecJ. Stock, Princeton, USA)


Légendes des photos :

Figure 1 : Le siteactif de la NDP kinase
La figure montre une molécule de dTDP fixée dans le site actif de la NDP kinase de Dictyostelium . On reconnaît l'histidine catalytique (H122) et plusieurs résidus contribuant à la fixation du nucléotide substrat. La liaison hydrogène cruciale entre le 3'OH du ribose et l'O7 du _-phosphate est indiquée.

Figure 2 : Le cycle de dévelopment de Dictyostelium discoideum
La figure montre les différentes phases qui conduisent à la morphobenèse, de l'agrégat multicellulaire à la forme fructifère.



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AYTAC Marie-Dominique (Institut Pasteur) – mdaytac@pasteur.fr

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GALLOIS-MONTBRUN Sarah (DEA) (Université Paris VI)

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CORTES Marie-Thérèse (Institut Pasteur – agent de laboratoire, IP)

GIACOMONI-FERNANDES Véronique (Technicienne supérieure, IP) – verofern@pasteur.fr

GOFFINONT Stéphane (Assistant Ingénieur CNRS) – sgoffi@pasteur.fr

TRAINCARD François (Ingénieur, IP) – traincar@pasteur.fr

POLOMACK Lucette (Technicienne supérieure, IP)


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