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  Pmtg


  Responsable : Maurice Hofnung (mhofnung@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité de Programmation Moléculaire et Toxicologie Génétique a quatre axes principaux de recherche. Deux axes dérivent de l'étude d'une région génétique complexe de la bactérie modèle Escherichia coli K12 déterminant le système de transport du maltose (la région malB). Le premier de ces axes est l'étude de séquences d'ADN répétées et dispersées sur le chromosome bactérien et découvertes initialement en malB. Le deuxième est l'étude de l'organisation, du fonctionnement, des interactions, et de la biogenèse des protéines du transporteur du maltose qui appartient à une des plus grandes familles phylogénétiques répandue dans tout le monde vivant ainsi que l'étude phylogénétique de cette famille, les systèmes ABC (ATP Binding Cassette) dépendants. Le troisième axe concerne les super-intégrons bactériens constitués par des suites de gènes mobiles du chromosome. Le quatrième axe aborde les effets sur les bactéries, et plus récemment sur les souris transgéniques, des agents capables de créer des dommages dans le matériel génétique, les agents génotoxiques.



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Premier thème. BIME, séquences répétées et génome. (Jean-Marie Clément, Sophie Bachellier, Caroline Wilde, Muguette Jehanno, Patricia Lambert).

La structure des chromosomes bactériens est encore mal connue, bien que plusieurs génomes aient été entièrement séquencés. Des séquences répétées, habituellement décrites chez les eucaryotes, sont également présentes en abondance chez les procaryotes. Outre les prophages, les transposons et les séquences d'insertion, des exemples de plus en plus nombreux viennent confirmer cette observation, et nous avons entrepris une analyse informatique systématique des génomes récemment séquencés pour mettre en évidence de nouvelles familles de séquences répétées entre les gènes. La fonction de ces séquences reste à ce jour hypothétique. Nous avons émis l'idée que certaines d'entre elles permettraient de structurer le chromosome en s'associant à des protéines.
Nous étudions plus particulièrement les BIME (Bacterial Interspersed Mosaic Elements), famille de séquences répétées extragéniques que nous avons dévouvertes chez E. coli et d'autres entérobactéries voisines, et dont la structure en mosaïque répond à une organisation précise. Nous avons développé une base de données consacrée à ce type de répétitions bactériennes, consultable à l'adresse suivante: www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/ (S. Bachellier).
Nous cherchons à élucider la fonction des BIME chez E. coli, notamment par l'identification de protéines s'y fixant. Trois ont déjà été identifiées, dont une chez nous, et pour en trouver d'autres, nous développons la technique du simple hybride chez la levure : des BIME de différentes structures ont été insérées dans un chromosome de levure, et des protéines de E. coli interagissant avec ces séquences ont été sélectionnées dans ce contexte par un crible fonctionnel. L'analyse de ces protéines est en cours: après purification leur interaction avec la séquence cible sera vérifiée in vitro. (S Bachellier, M Jehanno).
Une étude comparative des régions intergéniques d'isolats naturels d'E. coli a révélé l'existence d'une nouvelle séquence d'insertion (IS1397) qui semblait s'insérer spécifiquement dans les Unités Palindromiques (UP), l'un des motifs de base constitutifs des BIME. Une telle spécificité de cible est tout à fait originale. Nous avons montré que la surexpression de la transposase est toxique (filamentation des cellules et désagrégation du nucléoïde). Des mutants résistants peuvent être isolés et sont en cours de caractérisation. La mise au point d'outils génétiques appropriés a permis de sélectionner des événements de transposition d'IS1397 chez les entérobactéries. La transposition, qui ne nécessite pas la protéine RecA, se produit avec une spécificité quasi absolue au niveau des UP chez E. coli, Salmonella typhimurium et Klebsiella pneumoniae. IS1397 s'intègre néanmoins préférentiellement dans des UP de type E. coli, légèrement différentes du consensus défini pour les UP des autres espèces. Chez K. pneumoniae, une autre IS (ISKpn1) a été découverte qui semble spécifique des UP présentes chez cet organisme. Les mécanismes responsables de la différence de spécificité entre les deux IS sont à l'étude. Chez Yersinia pestis, proche d'E. coli mais dépourvue d'UP, la transposition d'IS1397 se produit soit en aval de séquences partageant une similitude avec les UP d'E. coli, soit en aval d'une séquence d'insertion dont les extrémités (Répétitions Inverses) sont semblables à celles d'IS1397. Nous avons mis en évidence des cercles composés du module transposable qui s'est excisé, probablement depuis un site chromosomique, ce qui confirme le rôle de tels cercles dans le mécanisme de transposition (JM Clément, C Wilde).
Nous cherchons à conforter notre hypothèse initiale d'un rôle des BIME dans la structure du chromosome. Des études sont en cours pour identifier des protéines qui se lient à la transposase d'IS1397 (double hybride chez la levure et étude de mutants résistants à l'action toxique de la transposase). La délétion systématique des BIME sur le chromosome est également (JM Clément, P Lambert).


Deuxième thème. Le complexe MalFGK2 du transporteur ABC du maltose et l'analyse phylogénétique des systèmes ABC (Elie Dassa, Philippe Bouige, Olivier Pellegrini, David Laurent, Tristan Rossignol)

La superfamille ABC (ATP-Binding Cassette) est composée de systèmes largement distribués dans tout le règne vivant, des bactéries à l'homme et elle constitue la plus grande famille de paralogues présents dans les banques de séquences. Chez l'homme, 15 maladies génétiques graves dont la mucoviscidose sont causées par le dysfonctionnement de systèmes ABC. La caractéristique la plus frappante de ses systèmes est de posséder un module protéique ATPasique très conservé d'environ 200 résidus appelé domaine ABC. La séquence primaire de ce domaine présente 3 principaux motifs conservés : les motifs A et B de Walker, trouvés dans les ATPases et un motif signature spécifique aux protéines de la famille. Le domaine ABC est capable de coupler l'énergie d'hydrolyse de l'ATP à une très vaste variété de processus cellulaires, incluant principalement le transport unidirectionnel de molécules à travers les membranes, mais aussi la transcription, la traduction et la protection de l'information génétique et leur régulation. Le système de transport du maltose et des maltodextrines de Escherichia coli constitue un paradigme pour les transporteurs ABC, en grande partie grâce à nos travaux. En effet, les systèmes ABC bactériens sont de loin ceux sur lesquels sont disponibles les informations fonctionnelles et structurales les plus détaillées. L'étude de leur mécanisme d'action peut donc enrichir et stimuler la recherche sur les systèmes ABC humains impliqués dans des manifestations pathologiques.
L'objectif principal de l'équipe est de comprendre la nature et le rôle des interactions qu'engagent les partenaires de systèmes transport à composants multiples de type ABC. Nous mettons en œuvre des méthodes génétiques et biochimiques destinées à mettre en évidence et à mesurer de telles interactions, et ainsi à définir des états structuraux et fonctionnels des sous unités du système de transport du maltose lors de son fonctionnement. Nous exploitons les informations dans les banques de données de séquence pour établir une classification phylogénétique et fonctionnelle des systèmes ABC répandus dans tout le règne vivant.
a) Interactions entre composants membranaires du système de transport du maltose (avec T Rossignol et O Pellegrini)
Les séquences des protéines intégrales de membrane des systèmes d'import bactériens présentent un court motif conservé appelé motif EAA et localisé à environ 100 résidus de l'extrémité C-terminale. Ce motif est hydrophile et il réside dans une boucle cytoplasmique. Nous avions proposé que les motifs EAA pouvaient être impliqués de façon directe dans l'interaction avec l'ATPase et probablement dans l'échange de signaux fonctionnels entre celle-ci et MalF et MalG. Par une technique de mutagenèse dirigée consistant à insérer des cystéines en des endroits choisis du complexe MalFGK2 et en effectuant des pontages à l'aide de réactifs homo-bifonctionnels spécifiques des cystéines, nous avons montré que les résidus du domaine hélical de MalK peuvent engager des interactions directes et asymétriques avec des résidus des motifs EAA de MalF et MalG. Ces interactions sont fortement modulées par l'ATP et suggèrent que ces changements dans les interactions pouvaient refléter l'existence de réarrangements structuraux qui sont requis pour le déclenchement de l'hydrolyse d'ATP nécessaire à la translocation du maltose. Plus récemment, nous avons montré que les régions EAA de MalF et MalG sont très proches puisqu'on détecte la formation de ponts disuslfure entre les cystéines que nous y avions insérées.
b) Evolution des systèmes ABC (avec D Laurent et P Bouige). Nos analyses les plus récentes indiquent que les systèmes ABC se répartissent en 3 classes phylogénétiques : les importeurs (présents uniquement chez les procaryotes, les exporteurs et les systèmes apparemment dépourvus de domaines transmembranaires qui seraient impliqués dans des phénomènes de régulation. Ces 3 classes recouvrent remarquablement bien les 3 classes fonctionnelles des systèmes ABC. L'analyse de la distribution des systèmes ABC dans les génomes complets ou quasi complets d'eucaryotes nous a livré plusieurs indications surprenantes. La levure (29 systèmes), la drosophile (55), l'homme (48) Ceanorhabditis elegans (60), Arabidopsis thaliana (116) présentent des systèmes ABC dont le nombre est du même ordre de grandeur et la nature remarquablement conservée. Dans les deux derniers organismes, le nombre plus élevé de systèmes est dû a des duplications extensives de certains gènes. Ceci suggère que, malgré l'existence de différences importantes dans le nombre total de gènes, les eucaryotes ont conservé un jeu relativement restreint de systèmes ABC essentiels. La deuxième surprise est l'identification de 6 systèmes ABC typiquement procaryotes dans le génome nucléaire de Arabidopsis thaliana. Ce résultat favoriserait l'hypothèse que les systèmes ABC eucaryotes ont été acquis essentiellement via les mitochondries et les plastes, et non pas directement de l'ancêtre commun des êtres vivants. Cette hypothèse sera établie plus solidement quand des génomes plus nombreux d'eucaryotes seront disponibles pour l'analyse.
Nous avons recensé dans les banques de séquences plus de 2650 ATPases de type ABC. Le nombre total de séquences impliquées dans la fonction de ces systèmes est de plus 7000 si on tient compte des protéines (protéines intégrales de membrane, protéines dites accessoires) que l'on sait être indispensables au fonctionnement de ces ATPases. Environ la moitié de ce nombre correspond à des systèmes identifiés dans les séquences complètes des génomes d'organismes variés et leur annotation est très limitée. Notre objectif est d'établir une base de connaissances de ces systèmes, qui comportera des informations sur la séquence, la fonction et la structure de ces systèmes. Ces informations seront issues des données acquises sur les systèmes modèles analysés expérimentalement. Notre base de données bibliographiques regroupe plus de 4000 références relatives à l'organisation fonctionnelle, la structure et les fonctions des systèmes ABC. Une version test de la base de données peut être consultée sur le site Internet suivant :


Notre troisième axe de recherche vise à identifier les fonctions des gènes constituant les super-intégrons ainsi que les mécanismes du recrutement et de l'insertion de ces gènes (Didier Mazel, Anne-Marie Guérout, Dean Rowe-Magnus, Latefa Biskri, Chiho Mashimo, Gaëlle Demarre).

Les transferts horizontaux de gènes jouent un rôle essentiel pour l'évolution des bactéries. On trouve de nombreux exemples, allant de l'acquisition de nouvelles capacités métaboliques à l'expression de nouveaux facteurs de virulence chez les pathogènes, pour illustrer cette observation. Toutefois, c'est très vraisemblablement dans l'émergence et le développement des multi-résistances au cours de la dernière moitié de ce siècle, que l'on trouve l'illustration la plus frappante et peut-être la plus préoccupante de l'importance de ces échanges génétiques. Dans ce phénomène global, la contribution d'une classe particulière d'éléments mobiles, les Intégrons, a été primordiale chez les bactéries à Gram négatif. Les intégrons constituent un véritable système de génie génétique naturel, dévoué à la capture et la dissémination d'ADN exogène. Nous avons montré l'existence d'une catégorie moins spécialisé d'Intégrons, les super-intégrons chromosomiques, qu'on trouve chez plusieurs genres bactériens appartenant aux protéobactéries (Vibrio, Shewanella, Xanthomonas, Pseudomonas, ...). Ces super-integrons rassemblent des dizaines de cassettes sur le chromosome de ces bactéries. Les relations phylogénétiques des integrases qui y sont associées laissent penser que ces structures dérivent d'un intégron hébergé par le génome de l'ancêtre commun à ces genres bactériens. Ainsi ce système joue et aurait joué un rôle de machine évolutive pendant des centaines de millions d'années. Actuellement, ces structures maintiennent un réservoir considérable de fonctions adaptatives variées (fonctions métaboliques, résistance, detoxification, virulence...). De plus, ce système semble capable de capturer des gènes d'origine extrêmement diverse, puisqu'on y trouve des gènes qui n'ont d'homologues décrits que chez des eucaryotes, des archaebactéries ou des virus. Nos études suggèrent que c'est dans ce groupe d'éléments qu'est l'origine des intégrons multi-résistants et de leur cassettes de résistance aux antibiotiques. Nos travaux portent sur les aspects suivants: l'inventaire de ces éléments et des fonctions qu'ils hébergent, l'expression des gènes à l'intérieur de ces structures, les mécanismes de recombinaison des cassettes de gène et le processus de genèse des cassettes. (www.pasteur.fr/recherche/unites/pmtg/integ/index.html).


Quatrième thème. Effets mutagènes d'agents de l'environnement (Philippe Quillardet, Eliette Touati, Xavier Arrault, Valérie Michel, Marie Ange Rouffaud).

Le groupe de Toxicologie génétique participe à la démarche préventive qui consiste à détecter les produits de l'environnement (les toxiques génétiques) capables d'altérer le génome de nos cellules (effets génotoxiques) et donc susceptibles d'y créer des mutations et être à l'origine de l'apparition de cancers chez l'homme.

Nous avons utilisé réponses génotoxiques de la cellule bactérienne, pour créer un test de dépistage des agents potentiellement mutagènes et/ou cancérogènes: le SOS chromotest. Ce test permet d'évaluer rapidement, de façon colorimétrique, l'aptitude d'un agent à endommager l'ADN. Il a été validé sur un grand nombre de substances (voir www.pasteur.fr/units/pmtg/).
Afin d'étudier les fonctions induites par un spectre plus large d'agents toxiques (génotoxiques potentiellement cancérogènes, cancérogènes non génotoxiques, divers polluants du milieu naturel), nous utilisons des matrices ("arrays") porteuses d'ADN correspondant aux phases ouvertes d'Escherichia coli.. Le but est de définir des classes d'agents toxiques sur la bases des gènes dont l'expression est induite chez Escherichia coli et de définir éventuellement des gènes, ou des groupes de gènes, diagnostiques de chaque classe. On considère le spectre des gènes dont l'expression est induite par un agent physique ou chimique comme une "signature" de l'action de cet agent sur la cellule.
La connaissance des gènes diagnostiques de classe d'agents toxiques devrait permettre de préciser les différents aspects de l'action de ces agents: métabolisme, activation, réponses réparatrices, et de dévoiler les propriétés d'ORF dont la fonction est actuellement inconnue. D'autre part, nous espérons aboutir à la construction de souches bactériennes portant des fusions entre ces gènes diagnostiques et un gène rapporteur permettant le dépistage de ces agents dans l'environnement même.

Nous nous intéressons aussi au mécanisme d'action d'agents génotoxiques. Nous avons tout particulièrement étudié le mécanisme d'action d'un mutagène extrêmement puissant chez les bactéries, un nitronaphtofuranne le R7000, représentant d'une famille chimique, les 5-nitrofurannes, couramment utilisés en médecine comme anti-parasitaire et anti-bactérien.
Notre objectif est d'expliquer en termes d'interactions moléculaires pourquoi le R7000 atteint des valeurs record de pouvoir mutagène. Nous avons localisé les dommages qu'il crée au niveau de l'ADN de la bactérie Escherichia coli et les mutations qui en résultent. Nous avons trouvé que le R7000 générait avec une très grande efficacité des adduits à l'ADN. Les adduits formés étaient dans presque tous les cas des guanines modifiées. Il en résulte principalement des substitutions de paire de base G:C›T:A et des délétions d'une paire de base G:C. Ces molécules de nitrofurannes doivent leur activité génotoxique à leur activation métabolique catalysée par des nitroréductases. Au cours de ce processus, le R7000 entraîne un stress oxydatif, soxRS-dépendant. Il s'agirait là d'un effet secondaire de ce composé mais qui pourrait illustrer une partie de sa génotoxicité.
Les effets de cette même molécule, sont aussi étudiés sur un modèle animal pour permettre de créer un lien plus direct entre les résultats obtenus chez les bactéries et ceux obtenus chez l'animal et nous donner ainsi les éléments pour l'extrapolation des résultats à l'homme. Nous avons utilisé des souris transgéniques communément appelées "Big Blue" c'est-à-dire présentant dans tous leurs chromosomes un gène étranger. Il s'agit ici d'un gène bactérien, le gène lacI, qui sert de rapporteur des effets mutagènes du produit. Il est ainsi possible de déterminer les organes de la souris qui sont la cible de cette action mutagène. Nous avons montré que le R7000 injecté par voie intrapéritonéale induit des mutations essentiellement au niveau des organes du système digestif: petit intestin, caecum et colon.
Le spectre de mutations induites par le R7000 chez la souris a été déterminé. Il est très similaire à celui qu'il induit chez E. coli. Ce résultat suggère que le mécanisme de l'action génotoxique du produit est très similaire chez ces deux organismes.
La nitrofurantoine et le nifuroxazide sont deux molécules de nitrofurannes couramment prescrites en médecine humaine, respectivement pour le traitement des infections urinaires et gastrointestinales. Afin d'évaluer les conséquences possibles à long terme de l'utilisation de telles molécules chez l'homme, l'effet mutagène de ces composés et du R7000 a été mesuré chez les souris transgéniques "Big Blue" après administration orale. Les résultats montrent un effet mutagène significatif au niveau de l'estomac, dans le cas du R7000 et au niveau des reins dans le cas de la nitrofurantoine. La détermination de la nature des mutations induites est en cours. Par contre aucune activité mutagène n'est observée chez les animaux traités par le nifuroxazide. Ces résultats, du moins en ce qui concerne le R7000 et la nitrofurantoine, confirment l'action génotoxique locale de ces composés.

Une autre étude menée dans le laboratoire vise à examiner pourquoi certaines maladies d'origine bactérienne peuvent à long terme évoluer en cancer. Les mêmes souris transgéniques sont un très bon outil pour évaluer si des mutations directement liées à l'infection bactérienne peuvent être responsables de ces cancers. Le modèle choisi est celui de l'infection par Helicobacter pylori, bactérie responsable des ulcères gastriques (en collaboration avec l'Unité dirigée par Agnès Labigne). Ces dernières années, les arguments en faveur du rôle étiologique de cette bactérie dans le développement des cancers gastriques se sont accumulés. Des facteurs bactériens, de l'hôte ou encore environmentaux sont susceptibles d'induire des évènements initiant un processus cancéreux.

La question que nous posons est de savoir, dans quelles conditions une infection chronique chez la souris peut être à l'origine d'une augmentation de la fréquence de mutagenèse au niveau des cellules épithéliales gastriques de ces animaux, et serait responsable de l'apparition de tumeurs gastriques. Ce travail implique ainsi la mise au point d'un modèle animal pour l'étude de cette infection.



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