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  Responsable : Vargaftig, B. Boris (vargafti@pasteur.fr)


  resume

 

Dans le cadre des recherches sur l'allergie des voies aériennes, nous avons étudié les mécanismes de tolérisation et la dissociation entre l'inflammation et la métaplasie mucipare dans le modèle murin dont nous disposons. Les études concernant le LPS ont été consacrés à ses effets sur les voies aériennes, par rapport aux récepteurs TLR et aux fonctions pulmonaires. Ces études intègrent les mécanismes de la transduction du signal par l'endothélium vasculaire pulmonaire ainsi que les interactions entre des phospholipases A2 et l'activité modulatrice du surfactant.



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Mécanismes de l'hyperréactivité bronchique allergique et non-allergique (B. Boris Vargaftig)

Les maladies inflammatoires pulmonaires, dont la prévalence est en croissance rapide, résultent de l'interaction entre des facteurs exogènes (exposition aux allergènes, infections, pollutions), et endogènes (intensité et nature des réponses lymphocytaires, par exemple). Notre Unité s'intéresse au contrôle immunologique et pharmacologique des atteintes inflammatoires pulmonaires, allergiques, environnementales et infectieuses. Dans le cas de l'allergie, ceci concerne les interactions entre les cellules présentatrices de l'antigène, les lymphocytes-T et les éosinophiles, qui constituent le vecteur potentiel des lésions épithéliales terminales. Ces interactions cellulaires aboutissent à et résultent de la production de cytokines pro-allergiques, IL-4, IL-5, IL-9 et IL-13 et d'une pléthore de chimiokines. L'on distingue actuellement au moins trois types de lymphocytes-T CD4+, les Th1 qui produisent de l'IL-2 et de l'IFN-g, les Th2 qui synthétisent de l'IL-4, de l'IL-5, de l'IL-9, de l'IL-13 et de l'IL-10, et les Th0 dont la production est moins sélective. L'allergie, y compris pulmonaire, concerne les lymphocytes Th2, les Th1 exercerçant un rôle plutôt anti-allergique. L'IL-4 joue un rôle essentiel dans l'engagement des lymphocytes dans la voie Th2 et dans la production d'IgE, tandis que l'IL-5 assure l'initiation et la pérennisation de l'éosinophilie. Nous corrélons les altérations immunologiques pulmonaires avec l'hyperréactivité broncho-pulmonaire (HRB) et la perméabilité vasculaire et des voies aériennes, deux composantes essentielles des réactions tardives de l'asthme. L'HRB est la capacité accrue des voies aériennes à répondre à des agents bronchoconstricteurs non-spécifiques qui marque l'asthme et corrèle avec l'éosinophilie des voies aériennes et avec une métaplasie mucipare plus tardive. La perméabilité accrue correspond à l'œdème des voies aériennes. Dans la mesure où la cytokine essentielle pour assurer une évolution " pro-allergique " vers les lymphocytes Th2 est l'IL-4, on s'attendait à ce que son absence ou sa neutralisation empêchent l'évolution vers l'allergie expérimentale. Il n'en est rien, puisque nous avons montré que les souris -/- pour la chaîne a du récepteur de l'IL-4 (-/- IL-4Ra) qui n'ont pas été éduquées pour produire des lymphocytes Th2 au moment adéquat (lors de l'immunisation primaire, p.ex.) expriment une HRB, produisent de l'IL-5, subissent une augmentation de la perméabilité vasculaire pulmonaire et recrutent des éosinophiles aux poumons, tout en ne produisant pas d'IL-4 ni des IgE contre l'ovalbumine contre laquelle ils sont sensibilisés. Dans des expériences préliminaires, les souris -/- pour l'IL-4 même ont répondu de manière identique. Il est proposé qu'en absence d'IL-4 il y ait quand même orientation Th2, ce dont témoignent la production d'IL-5 et l'éosinophilie, mais sans IL-4.
Nous avions montré que la métaplasie mucipare et l'inflammation éosinophilique qui suivent la provocation allergénique sont dissociables. Nous montrons maintenant que l'administration orale d'ovalbumine avant ou pendant l'immunisation supprime l'expression ultérieure des séquelles de la provocation allergénique : HRB, éosinophilie des voies aériennes et de la moëlle osseuse, production accrue d'IL-4, d'IL-5 et d'IgE spécifique, en absence d'augmentation de la production d'IFN g ou d'IL-12. Il est donc possible d'empêcher l'ensemble de l'allergie des voies aériennes chez la souris, aiguë ou en voie de chronification, par tolérisation exclusive.


Mécanismes de l'yperréactivité broncho-pulmonaire non-allergique (B. Boris Vargaftig)

Trois événements essentiels suivent l'administration l'endotoxine bactérienne (LPS) aux voies aériennes des souris : l'activation des macrophages alvéolaires, le recrutement et l'activation des neutrophiles et l'augmentation de la perméabilité vasculaire, avec un syndrome de fuite vasculaire qui rappelle celui qui prévaut lors du Syndrome de Détresse Respiratoire Aigu (SRDA). Nous avions démontré que l'administration i.v. ou i.p. de LPS à des souris C57BL/6 est suivie de l' adhérence des neutrophiles à l'endothélium vasculaire pulmonaire, en absence de migration au compartiment alvéolaire. Puisqu'il n'y a pas de diapédèse, il n'y a donc pas d'inflammation au sens strict, mais plutôt un état de " pré-inflammation ", même si le LPS a bien atteint les poumons, dans la mesure où l'ARN du TNF-a a bien été surexprimé, sans que la protéine TNF-a soit présente le liquide de lavage. Malgré la pauvreté des modifications mécaniques respiratoires, une intense HRB a été vérifIée suite à l'administration de méthacholine par aérosol. Ceci ne résultait pas de la production de TNF-a ni de la séquestration de polynucléaires neutrophiles, puisque cette HRB persistait malgré la déplétion des neutrophiles par des anticorps ou des agents myélotoxiques. Le LPS serait ainsi responsable de la production d'un signal local (pulmonaire ?) ou systémique pour le recrutement de neutrophiles, mais indépendamment du TNF-a.
Les effets de l'administration du LPS par voie aérienne diffèrent beaucoup des effets systémiques. Une bronchoconstriction " directe " très intense est notée 70-90 mn après l'instillation ou l'administration intra-trachéale de LPS, avec migration massive de neutrophiles dans les voies aériennes et plus tard, dans le liquide de lavage bornchoalvéolaire, et la production de TNF-a, probablement par les macrophages alvéolaires. Ce recrutement a été suivi par l'enrichissement en protéines du liquide de lavage bronchoalvéolaire, et par l'augmentation du poids pulmonaire, deux marqueurs de la souffrance alvéolo-capillaire. Dans des études séparées avec l'Unité d'Immunogénétique cellulaire, nous avons montré que le syndrome de détresse vasculaire, qui interfère négativement avec l'action thérapeutique de l'IL-2, peut être reproduit chez la souris, lorsqu'elle est administrée systémiquement pendant 4 jours, en absence de recrutement de neutrophiles et d'HRB.
Les agents anti-inflammatoires stéroïdiens, qui suppriment la production de TNF-a et empêchent l'HRB due au LPS administré par voie i.p., n'ont montré aucune activité inhibitrice vis-à-vis de la bronchoconstriction due au LPS administré par voie intra-nasale. Paradoxalement, des doses considérables de dexaméthasone ou de budésonide ont en fait augmenté l'HRB. De même, un effet protecteur discret des stéroïdes sur l'exsudation protéique due au LPS a été suivi par son aggravation lorsque des doses plus fortes ont été employées. Par ailleurs, la bronchoconstriction " directe " due au LPS, ainsi que la séquestration de neutrophiles, sont restées pratiquement identiques, même si le recrutement des neutrophiles au compartiment alvéolaire et la production de TNF-a étaient supprimés. Nos résultats indiquent que les mécanismes d'adhérence vasculaire et le passage ultérieur de neutrophiles au compartiment alvéolaire sont respectivement non contrôlables et contrôlables par les glucocorticosteroïdes. Les difficultés notoires pour contrôler le SDRA par les glucocorticosteroïdes sont mimées dans notre modèle.


Interactions cellulaires dans l'environnement aérien pulmonaire (Michel Chignard, Dominique Pidard et Mustapha Si-Tahar)

Les macrophages et les polynucléaires neutrophiles participent activement aux pathologies pulmonaires inflammatoires et infectieuses. Ces pathologies incluent l'emphysème, le syndrome de détresse respiratoire aiguë, la bronchite chronique, la mucoviscidose ou encore l'aspergillose invasive.
Dans le cas des neutrophiles, leurs effets s'exercent en particulier au travers de la libération de trois sérine protéinases, l'élastase, la cathepsine G et la protéinase 3. Nous nous sommes attachés à analyser l'activité de ces protéinases sur divers récepteurs membranaires impliqués dans l'activation ou dans les propriétés d'adhérence de cellules de la défense innée et de l'inflammation. Ainsi, après avoir montré que l'élastase et la cathepsine G agissent sur les cellules endothéliales en inhibant spécifiquement leur activation par la thrombine, au travers de la protéolyse de son récepteur, le "Proteinase-activated receptor-1" (PAR-1), des expériences en cours montrent que ces mêmes protéinases clivent le récepteur PAR-2 exprimé sur des cellules épithéliales pulmonaires. Ce récepteur, dont on ne connaît pas l'agoniste physiologique, serait impliqué dans les mécanismes de défense innée et d'inflammation. Par ailleurs, nous venons de montrer que l'élastase et la cathepsine G inhibent l'activation des monocytes exposés au LPS, un composé pariétal de bactéries Gram négatif, en agissant sur un récepteur membranaire spécifique, le CD14. Dépourvu d'un domaine transmembranaire capable d'induire une signalisation cellulaire, le CD14 agit de concert avec des récepteurs récemment identifiés appelés "Toll-like receptors" (TLR). Ces récepteurs permettent aux cellules qui les expriment de détecter la présence de pathogènes et de déclencher les mécanismes de défense innée. Nous étudions actuellement l'expression et le rôle de ces récepteurs au niveau des cellules pulmonaires et plus particulièrement de l'épithélium. Des travaux sont également en cours montrant un effet de l'élastase et de la cathepsine G sur les neutrophiles eux-mêmes. Ainsi, nous avons observé qu'elles diminuent l'expression membranaire de CD87/uPAR (urokinase-plasminogen activator receptor), une glycoprotéine également exprimée par les monocytes et les cellules épithéliales, et impliquée dans les mécanismes d'adhérence et de réparation tissulaire.
Dans un modèle expérimental murin, nous avons montré que l'administration de LPS dans les voies aériennes induit la migration des neutrophiles, et la libération d'élastase dans les espaces aériens. Paradoxalement, la présence des neutrophiles est corrélée avec l'apparition d'une activité anti-élastase dont l'origine serait l'ADN provenant de cellules altérées localement. La migration des neutrophiles est contrôlée, en partie, par le TNF-alpha produit par les macrophages alvéolaires activés par le LPS. De façon inattendue, ces mêmes macrophages activés sont incapables de synthétiser l'IL-10, une cytokine anti-inflammatoire. Il apparaît qu'une protéine du surfactant pulmonaire, la SP-A, pourrait expliquer ce phénotype particulier car nous avons observé qu'elle est capable de réprimer la synthèse d'IL-10 par les cellules de la lignée monocytaire. Toutefois, lors d'une infection pulmonaire expérimentale létale provoquée par Aspergillus fumigatus chez la souris, de l'IL-10 est détectée dans les espaces aériens. Cette production pourrait être impliquée dans la mortalité des animaux. Il faut noter que dans ce modèle d'aspergillose invasive, les neutrophiles jouent un rôle défensif primordial, ce qui ne semble pas être le cas des macrophages alvéolaires.


Rôle de la phospholipase A2 dans l'inflammation pulmonaire (Lhousseine Touqui)

La phospholipase A2 (PLA2) catalyse l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2 conduisant à la génération de lysophospholipides cytotoxiques et d'acides gras libres dont l'acide arachidonique (AA). Ce dernier est le précurseur des leucotriènes et des prostaglandines doués d'activités biologiques diverses et impliquées dans différentes pathologies inflammatoires. Il existe plusieurs types de PLA2s dont les gènes ont été clonés et classés en deux groupes: les PLA2 cytosoliques et les PLA2 sécrétées (sPLA2). La sPLA2 de type-II (sPLA2-II) jouerait un rôle important dans des maladies inflammatoires comme l'arthrite rhumatoïde, le choc septique, les rhinites allergiques, ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Nous avons mis au point un modèle animal qui reproduit les critères anatomo-pathologiques du SDRA chez l'homme. Ce modèle est basé sur l'administration d'une endotoxine bactérienne, le lipopolysaccharide (LPS), par voie intra-trachéale chez le cobaye. Nous avons montré que le LPS provoque une inflammation pulmonaire aiguë accompagnée d'une expression accrue de la sPLA2-II et de sa libération dans l'espace alvéolaire. Les macrophages alvéolaires (MA) sont la principale source de cette enzyme dont l'expression est induite par un processus autocrine/paracrine médié par le TNF-alpha et inhibé par l'AMPc. La stimulation de la synthèse de la sPLA2-II est due à l'induction de cette enzyme à un niveau transcriptionel par un processus dépendant de NF-kB. L'AA inhibe l'expression de la sPLA2-II par un mécanisme impliquant les métabolites de la voie cyclooxygénase et aboutissant à un blocage de NF-kB. Nous avons montré que la sPLA2-II est responsable dans l'hydrolyse des phospholipides du surfactant pulmonaire et suggéré que ce processus pourrait être impliqué dans l'altération du surfactant. Cette altération est une caractéristique du SDRA conduisant à l'apposition permanente des parois alvéolaires entravant ainsi la diffusion de l'oxygène. Nous avons également montré que cette hydrolyse est régulée par une protéine du surfactant, la SP-A (surfactant protein A) qui inhibe l'activité de la sPLA2-II par une interaction spécifique et calcium-dépendante. Cette interaction est probablement un mécanisme de défense permettant à l'organisme de protéger le surfactant contre l'action délétère de la sPLA2-II.


Etude des voies de signalisation au sein des plaquettes et des cellules endothéliales pulmonaires humaines (Mohamed Hatmi)

Les cellules endothéliales, principale composante de l'endothélium vasculaire, tapissent la paroi des vaisseaux et interagissent avec les cellules sanguines circulantes en particulier, les plaquettes. Les cellules endothéliales et les plaquettes jouent un rôle clé dans l'hémostase et la thrombose et participent activement aux différents processus inflammatoires. Les voies de signalisation impliquées dans leur activation sont complexes et mettent en jeu de nombreuses enzymes dont les cyclooxygénases, les protéines kinases et les métalloprotéinases.
Nous nous intéressons à l'étude des métalloprotéinases (MMPs), une famille d'enzymes impliquées dans divers processus physiopathologiques comme le remaniement de la matrice extracellulaire, la dissémination métastasique et l'inflammation. Nous avons étudié l'expression de ces enzymes au sein des plaquettes humaines et nous avons recherché leurs effets potentiels sur la réactivité plaquettaire. Nous avons, ainsi, montré la présence de la MT1-MMP, une métalloprotéinase activatrice de la MMP2, à la fois dans le sérum et dans le plasma de volontaires sains. Nous avons, ensuite, établi que la MT1-MMP est exprimée à la surface plaquettaire sous forme de deux espèces moléculaires de 45 et 89 kDa. Après dégranulation des plaquettes, seule celle de faible masse moléculaire persiste. Nous avons montré, par ailleurs, que les plaquettes possèdent les ARNm codant pour la MT1-MMP, la MMP2 et le TIMP2. L'expression par ces cellules des trois éléments composant le complexe trimoléculaire nécessaire à l'activation de la pro-MMP2 a été mise en évidence par cytométrie en flux sur des plaquettes activées.
Nous nous intéressons, d'autre part, à l'étude de la modulation de l'expression de la cyclooxygénase de type 2 (Cox-2) endothéliale par des cytokines proinflammatoires et par l'AMPc, un nucléotide généré à partir de l'ATP sous l'action de l'adénylyl cyclase.
Nous avons démontré que les cellules endothéliales pulmonaires humaines des microvaisseaux (CEPHMV) expriment à leur surface une protéine kinase A (PKA). Cette enzyme dont l'activité est étroitement dépendante de l'AMPc extracellulaire, inhibe l'induction de la Cox-2.
Nous avons montré, d'abord, que la Cox-2 est fortement induite par l'ester de phorbol (PMA), de manière précoce dans les CEPHMV. Nous avons ensuite montré, par différentes approches expérimentales, que l'AMPc extracellulaire inhibe cette induction de la Cox-2. Nous avons aussi quantifié l'activité Cox en évaluant la production de la 6-cétoPGF1alpha, principal produit de dégradation de la prostacycline. La synthèse de ce métabolite, accrue sous l'action du PMA, est fortement réduite par l'AMPc extracellulaire. Cette activité ecto-PKA endothéliale indique que l'AMPc est non seulement un second messager intracellulaire mais aussi extracellulaire.
Nous avons montré, par ailleurs, que le TNFalpha, contrairement à l'IL-1beta, est incapable d'induire une expression de la Cox-2 endothéliale. En revanche, associé à l'IL-1beta, le TNFalpha augmente considérablement l'expression de cette enzyme, vraisemblablement en activant le facteur de transcription NF-kappa B. Le TNFalphaseul, à l'inverse de l'IL-1beta est incapable d'activer la p38 MAP kinase. De même, l'inhibition spécifique de cette enzyme supprime l'induction de la Cox-2, soulignant ainsi l'importance de cette voie enzymatique dans ce processus.
En conclusion, notre thème de recherche est centré sur l'étude des voies de signalisation impliquées dans les fonctions plaquettaires et endothéliales, en particulier les rôles des PKA et des enzymes proinflammatoires telles que les métalloprotéinases matricielles et la Cox-2.



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