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  Responsable : DELEPIERRE Muriel (murield@pasteur.fr )


  resume

 

Notre activité est centrée sur l'étude des relations structure-fonction des molécules biologiques et des problèmes de reconnaissance moléculaire ADN-protéine, protéine-protéine, oligosaccharide-protéine. Ces thèmes sont développés en étroite collaboration avec les équipes de l'Institut Pasteur.



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Etudes fonctionnelles et structurales de protéines impliquées dans les mécanismes d'acquisition de l'hème (Anne Lecroisey, Clarisse Deniau, Nicolas Wolff, Catherine Simenel, Joël Couprie)

HasA, une protéine de 19 Kda, est sécrétée en condition de carence en fer par la bactérie gram-négative Serratia marcescens. HasA possède une très forte affinité pour l'hème et est capable de capturer l'hème libre ou l'hème lié à l'hémoglobine permettant à la bactérie de croître en absence de tout autre source d'hème. elle agit comme un sidérophore protéinique en capturant l'hème du milieu extracellulaire et en le délivrant à un récepteur spécifique, HasR, situé dans la membrane externe. HasA ne possède aucune homologie de séquence avec d'autres protéines connues à l'exception de trois autres hémophores récemment identifiés dans des espèces différentes Pseudomonas aeriuginosa, Pseudomonas fluorescens et Yersinia Pestis. Toutes ces protéines sont sécrétées par un système de sécrétion qui implique un signal C-terminal et un transporteur ABC. HasA se lie à l'hème de façon stoechiométrique avec une très forte affinité Kd = 3.10-11 M. La structure tridimensionnelle de HasA a été déterminée, par diffraction des rayons X pour la forme holo et par RMN pour la forme apo et ce afin de comprendre les mécanismes de capture et de relargage de l'hème au niveau moléculaire. De plus, chacun des trois résidus importants pour la fixation de l'hème His32, Tyr75 et His83 a été muté in vitro par mutagénèse dirigée et les propriétés biologiques et physicochimiques des mutants analysées en termes de stabilité, d'affinité pour l'hème ou encore d'intégrité structurale. Enfin les pKas des histidines dans les formes apo- et holo- ont été mesurés ce qui a permis de faire des hypothèses sur le mécanisme de capture de l'hème.


Etude structurale et dynamique du domaine C-terminal de la tyrosyl-tRNA synthétase de Bacillus Stéarothermophilus (Inaki Guijarro, Ada Prochnicka-Chalufour, Catherine Simenel, Muriel Delepierre)

Les aminoacyl-tRNA synthétases sont les enzymes qui traduisent le code génétique in vivo en attachant les acides aminés aux ARNs de transfert (tRNA) apparentés. Elles catalysent une réaction qui nécessite la présence d'ATP et qui se déroule en deux étapes (i) activation de l'acide aminé par l'ATP sur le phosphate  (ii) puis transfert de l'aminoacyl adénylate sur le ribose 3'-terminal de l'ARN de transfert approprié. Elles constituent donc des cibles potentielles pour de nouveaux antibiotiques. Malgré des succès spectaculaires, des lacunes persistent dans leur connaissance structurale. A titre d'exemple, le domaine C-terminal (320-419) de la tyrosyl-tRNA synthétase de bacillus stéarothermophilus impliqué dans la reconnaissance de l'anticodon du tRNA-Tyr, est désordonné dans les cristaux, et sa structure reste inconnue. La structure et la dynamique de ce domaine ont été étudiées en solution par RMN en collaboration avec le groupe d'Ingiénérie des protéines (Hugues Bedouelle).
Le domaine C-terminal de la TyrRS est de type a/b et ne ressemble à aucun autre domaine de reconnaissance de l'anticodon connu pour le moment mais possède des homologies structurales avec la protéine ribosomale S4 ainsi que la protéine de choc thermique Hsp15. La topologie commune à ces molécules implique deux hélices  posées sur un feuillet b. Ces observations semblent aller dans le sens d'une nouvelle classe de domaines de reconnaissance de l'anticodon au sein de la famille des aminoacyl tRNA synthétases. Une étude dynamique montre que le domaine C-terminal se comporte comme une protéine globulaire et que l'extrémité N-terminale est beaucoup plus mobile que l'extrémité C-terminale. Le désordre observé dans la structure serait donc du à la présence d'un lien flexible entre les domaines N-terminal et C-terminal de la protéine. Enfin, les six résidus identifiés par mutagénèse dirigée comme étant essentiels pour l'association à l'ARN de transfert se trouvent à la surface de la molécule et exposés au solvent.


Structure de l'ADN et interaction ADN-protéine (Karine Wecker, Muriel Delepierre)

NF-kB est impliqué dans la régulation transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes dont ceux du HIV. Les structures en solution de fragments d'ADN de 16 paires de bases correspondant au site -kB du HIV (16N) et de séquences mutées (16 M1 et 16 M2) ont été déterminées par RMN du proton et du phosphore. Les séquences mutées correspondent soit à une mutation dans le site -kB (16M1) soit à une mutation dans les séquences flanquantes (16M2). Les données RMN ont permis de mettre en évidence un comportement dynamique des brins phosphodiesters. Ainsi, pour le duplex natif, un équilibre BI-BII (deux conformations différentes de la chaîne phosphodiester) au niveau des sites entourant les dix paires de bases du site kB induit des changements structuraux importants du site kB. Une modélisation moléculaire des conformations extrêmes atteintes par le duplex natif (16N) a montré que celui-ci présente une conformation particulière lorsque les phosphates des séquences flanquantes du site -kB sont en conformation BII et dans laquelle toutes les paires de bases sont déplacées dans le grand sillon de l'ADN et l'hélice est courbée de 40° du côté du grand sillon comme dans les complexes cristallographiques ADN/ NF-kB. Les séquences mutées que ce soit le duplex 16M1 mais surtout pour le duplex 16M2 pour lequel il n'y plus de phosphore en conformation BII ne présentent pas ces caractéristiques structurales et nous avons montré que l'association à NF-kB était moins éfficace (16M2) voire abolie (collaboration E. Meurs). Ainsi, l'ensemble de ces résultats montre, pour la première fois, des différences importantes entre un ADN natif et un ADN muté dans la structure, la dynamique, et l'accessibilité des atomes du grand sillon où la protéine vient s'ancrer. Une nouvelle courbure dynamique et intrinsèque, liée à un effet de séquence a été mise en évidence sur le duplex natif. Les séquences flanquant le site kB ont un rôle primordial pour ses propriétés intrinsèques.


Etude structurale de déterminants antigéniques reconnus par un anticorps monoclonal protecteur dans le cadre du développement d'un vaccin contre la shigellose (Marie-Jeanne Clément, Catherine Simenel, Muriel Delepierre)

Ce projet entre dans le cadre de l'étude des polysaccharides bactériens en relation avec le développement de vaccins synthétiques chimiquement définis. Il fait l'objet d'une collaboration les Unités de Pathogénie Microbienne Moléculaire, de Chimie Organique et d'Immunologie Structurale. Shigella flexneri est une bactérie à gram négatif responsable de la forme endémique de la shigellose, une infection recto-colique aigüe dont les principales victimes sont les enfants de moins de cinq ans dans les pays en voie de développement. L'augmentation du nombre de souches de Shigella résistantes aux antibiotiques, rend la vaccination l'unique moyen d'éradication de la maladie. Le développement d'un vaccin contre la shigellose fait partie des priorités de l'O.M.S. dans le cadre du développement de vaccins entériques. La protection contre une infection par Shigella repose essentiellement sur la réponse humorale locale dirigée contre la partie polyosidique du lypopolysaccharide appelée antigène-O (Ag-O). De plus, les anticorps conférant cette protection sont specifiques du sérotype de la souche de Shigella défini par la structure de l'Ag-O. Une stratégie possible pour la vaccination humaine consiste donc à développer des vaccins synthétiques chimiquement définis avec des molécules simples capables de mimer l'Ag-O et d'induire la synthèse d'anticorps protecteurs. Deux approches ont été développées qui consistent à utiliser soit des oligosaccharides synthétiques représentatifs des épitopes osidiques reconnus par des anticorps protecteurs soit des séquences peptidiques mimant les épitopes protecteurs. Le développement de chacune de ces deux options requiert une étude structurale de l'interaction des oligosaccharides et des peptides avec des anticorps protecteurs afin d'appréhender les bases moléculaires impliquées dans la reconnaissance antigène-anticorps et à ainsi définir la structure optimale mimant l'Ag-O. Les structures en solution des oligosaccharides synthétiques et des séquences peptidiques immunogéniques ont été étudiées par RMN soit sous formes libres soit sous forme liées à des anticorps protecteurs.



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
 

LOZANO Liliane IP llozano@pasteur.fr

DELEPIERRE Muriel, CNRS murield@pasteur.fr

GUIJARRO Inaki, IP guijarro@pasteur.fr

LECROISEY Anne, IP alecrois@pasteur.fr

WOLFF Nicolas, IP wolff@pasteur.fr

CLEMENT Marie-Jeanne, thèse mjeanne@pasteur.fr

COUPRIE Joël, Post-doc jcouprie@pasteur.fr

DENIAU Clarisse, thèse cdeniau@pasteur.fr

OLIVERIA DE SOUSA Katya, post-doc Brésilienne

WECKER Karine, post-doc wecker@pasteur.fr

LOZANO Liliane, secrétaire Administratif IP llozano@pasteur.fr

PROCHNICKA-CHALUFOUR Ada Ing IP ada@pasteur.fr

SIMENEL Catherine, Ing IP simenel@pasteur.fr


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