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  Responsable : COLE Stewart (stcole@pasteur.fr)


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Afin de continuer notre avancée dans la connaissance de la tuberculose et de la lèpre, une approche de génomique comparative et fonctionnelle a été entreprise sur leurs agents étiologiques respectifs, Mycobacterium tuberculosis et M. leprae. De nouvelles cibles pour la mise au point de médicaments et de nouveaux candidats vaccins sous-unitaires ont été identifiés et sont actuellement en cours de caractérisation. Le pouvoir pathogène de Clostridium difficile et de C. perfringens est causé par de puissantes toxines, et on a découvert qu'un nouveau facteur sigma est nécessaire à la transcription des gènes des toxines majeures de C. difficile.



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Génomique comparative mycobactérienne(Stewart Cole, Karin Eiglmeier, Thierry Garnier)

Nous avons ces dernières années, déterminé et analysé la séquence complète du génome de Mycobacterium tuberculosis H37Rv et de M. leprae, et établi des bases de données relationnelles pour diffuser les résultats. La séquence du génome du pathogène animal, M. bovis, et celle de la souche vaccinale, M. bovis BCG Pasteur, sont actuellement en cours d'achèvement et leur comparaison devrait nous permettre de comprendre le mécanisme d'atténuation du BCG et de mettre au point des vaccins antituberculeux plus performants. Un cas exceptionnel d'évolution réductive a été découvert à l'occasion d'études de génomique comparative des bacilles de la lèpre et de la tuberculose qui sont étroitement liés. Plus de 50 % du génome de M. leprae, dont la taille est inférieure de 1.1 Mb à celle de M. tuberculosis (4.4Mb), est constitué de pseudogènes qui ont encore leur homologue fonctionnel chez le bacille tuberculeux. Cette perte massive de gènes est en partie la raison de notre incapacité à cultiver M. leprae en laboratoire, et explique son temps de génération exceptionnellement long (14 jours). La génomique comparative a non seulement permis la définition d'un ensemble minimum de gènes pour une mycobactérie pathogène intracellulaire, mais aussi l'identification d'environ une centaine de protéines inconnues qui sont inhérentes au genre. Ces protéines présentent un intérêt à la fois pour la découverte de nouvelles cibles dans la mise au point de médicaments et pour le développement de vaccins, et elles feront l'objet de travaux approfondis sur le plan fonctionnel et structural.

Mycobacterium ulcerans, pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli, responsable de lésions de la peau chroniques et nécrosantes, s'est rapidement révélé être une cause importante de morbidité à travers le monde. L'ulcère de Buruli est la troisième maladie mycobactérienne la plus répandue après la tuberculose et la lèpre, et il n'existe actuellement aucun vaccin ou traitement, hormis la chirurgie. Contrairement aux autres mycobactéries, M. ulcerans demeure extracellulaire pendant la durée de l'infection et produit une toxine macrolide, la mycolactone. On a actuellement recours à la génomique afin de comprendre l'épidémiologie de la maladie et trouver de nouveaux moyens thérapeutiques. Cette approche permettra de tester l'hypothèse que M. ulcerans est dérivé de M. marinum, un pathogène intracellulaire du poisson et de l'homme que l'on retrouve dans la plupart des milieux aquatiques de la planète.


Génomique comparative et fonctionnelle du complexe M. tuberculosis(Roland Brosch, Stewart Cole)

Outre M. tuberculosis, M. bovis et M. bovis BCG, le complexe M. tuberculosis comprend également M. africanum, M. microti et M. cannettii. Bien que ces espèces présentent une identité supérieure à 99,93% dans leur séquence d'ADN, elles diffèrent largement dans leur spectre d'hôte : M. tuberculosis se limite à l'homme, alors que M. bovis est susceptible d'infecter une grande variété de mammifères. De plus, leur capacité à causer la maladie chez l'homme varie considérablement ; M. bovis BCG et M. microti sont tous les deux des vaccins vivants inoffensifs, alors que les autres espèces sont pathogènes.
Pour élucider les bases moléculaires de ces dissemblances, différentes technologies d'arrays et de cartographie ont été utilisées afin d'explorer leur diversité génomique. Ceci a mené à l'identification de loci variables qui se sont trouvé modifiés en raison de délétions, d'insertions ou de phénomènes de duplication. Ces résultats ont permis de définir un degré de parenté basé sur le nombre de gènes et l'organisation génomique, dans lequel M. tuberculosis est plus proche que les autres de l'ancêtre commun des membres du complexe, et que M. bovis BCG constitue l'élément le plus divergent. Un nombre important de gènes qui ont disparu lors de l'évolution de M. bovis BCG ont été réintroduits et les conséquences sur le phénotype et la virulence ont été évalués.


Résistance aux antibiotiques de M. tuberculosis et M. leprae(Stewart Cole, Nadine Honoré, Brigitte Saint-Joanis)

La sensibilité de M. tuberculosis à l'isoniazide (INH) résulte de l'activation enzymatique de ce puissant agent antituberculeux par la catalase-peroxydase (KatG), le facteur de virulence majeur. Le gène katG est situé en aval de furA, qui code pour un régulateur potentiel et les gènes sont co-transcrits. Leur rôle respectif dans la sensibilité à l'INH et la virulence de M. tuberculosis ont été évalués par complémentation d'une souche D(furA-katG) qui est fortement atténuée chez un modèle animal. En l'absence de furA, katG a été surexprimé et la sensibilité à l'isoniazide et la virulence restaurées, indiquant ainsi que les deux gènes sont sous le contrôle de FurA. Quand furA seul a été introduit dans le mutant D(furA-katG), la virulence a été partiellement rétablie ce qui démontre que FurA contrôle d'autres gènes que katG, qui sont également impliqués dans la pathogénicité.
Les mutants dépourvus de katG surproduisent l'alkyl-hyperoxyde réductase, AhpC, une enzyme capable de supprimer la toxicité de l'INH activé. Cet enzyme dodécaméric a été purifié et sa structure cristalline élucidée par l'unité de Biochimie Structurale.


Étude du pouvoir pathogène et de la résistance aux antibiotiques des Clostridies (Gilles Reysset, Bruno Dupuy)

Les recherches menées sur le pouvoir pathogène de Clostridies toxinogènes (Clostridium perfringens et Clostridium difficile), sont destinées à comprendre les mécanismes de régulation des principales exotoxines connues, et à identifier et caractériser de nouveaux facteurs de virulence pouvant être impliqués dans la pathogénie de ces deux bactéries.
L'adaptation aux stress oxydatifs de C. perfringens, agent responsable de maladies pouvant aller de la simple intoxication alimentaire à l'entérite nécrotique ou la gangrène gazeuse, constitue vraisemblablement un facteur de pathogénicité important pour cette bactérie ubiquitaire. Certains gènes intervenant dans cette réponse ont été identifiés après mutagenèse par le transposon Tn916 et sont en cours d'étude. La recherche de nouvelles cibles permettant l'élaboration d'inhibiteurs puissants capables de contrôler l'initiation et/ou l'établissement de ces organismes lors des infections, nous a amenés à travailler sur l'organisation fonctionnelle de quatre protéines CBP (Choline Binding Protein), appartenant à la famille réduite des protéines affines aux résidus cholines. Toutes ces protéines sont homologues à la protéine membranaire immunogène PspA de Steptococcus pneumoniae, indispensable à la virulence de cette bactérie.
Le pouvoir pathogène de C. difficile, responsable de colites pseudomembraneuses et de la majorité des diarrhées post-antibiothérapiques, repose essentiellement sur sa capacité à produire en quantités suffisantes deux toxines majeures, ToxA et ToxB. Nous venons de démontrer que la transcription des gènes tox est sous le contrôle d'un nouveau mode de régulation qui nécessite la présence du produit du gène txeR, appartenant à la famille des facteurs sigmas alternatifs. Ce facteur sigma intervient sur l'expression des toxines A et B en réponse aux changements de l'environnement. Nous recherchons actuellement si l'activateur VirR du système à deux composants VirR/VirS, est capable de moduler l'expression des toxines A et B.
Enfin, les résultats obtenus sur l'étude de la résistance au métronidazole de C. difficile, en collaboration avec une équipe de l'Hôpital Saint-Antoine, suggèrent que nous avons affaire à un mécanisme d'inactivation de l'antibiotique, différent de celui mis en évidence chez Bacteroides fragilis, que nous essayons actuellement d'identifier.



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